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摘要

在 秀丽隐杆线 虫兴奋性毒性模型中，该方案采用体内成像来分析坏死性神经变性的调节、编码候选介质的基因的影响以及线粒体的参与。细胞解离和分选用于特异性获得高危神经元，用于神经退行性和神经保护机制的细胞特异性转录组学分析。

摘要

兴奋性中毒性坏死是神经退行性变的一种主要形式。这种调节坏死的过程是由神经递质谷氨酸的突触积累及其突触后受体的过度刺激触发的。然而，缺乏关于最终导致这种神经退行性变的不同神经元肿胀形态的后续分子事件的信息。其他方面，例如特定亚细胞区室的变化，或不同神经元亚型的差异细胞脆弱性的基础，仍未得到充分探索。此外，在使用体外或离体制剂的研究中发挥作用的一系列因素可能会改变和扭曲这种形式的神经退行性变的自然进展。因此，通过监测调节线 虫秀丽隐杆线虫遗传适应性和透明模型系统中神经元坏死程度的干预措施的效果来研究活体动物的兴奋性毒性坏死非常重要。该方案描述了研究 秀丽隐杆线 虫神经元兴奋性毒性坏死的方法，结合了光学、遗传和分子分析。为了诱导 秀丽隐杆线虫的兴奋性毒性条件，将谷氨酸转运蛋白基因 （glt-3） 的敲除与神经元致敏遗传背景 （nuls5 [Pglr-1：：GαS（Q227L）] 相结合，产生谷氨酸受体过度刺激和神经退行性变。活体动物的 Nomarski 微分干涉对比 （DIC）、荧光和共聚焦显微镜是用于量化神经退行性变、跟踪荧光标记蛋白的亚细胞定位以及量化退化神经元中线粒体形态的方法。神经元荧光激活细胞分选 （FACS） 用于对高危神经元进行独特分选，用于神经退行性变的细胞类型特异性转录组学分析。实时成像和 FACS 方法的结合以及 秀丽隐杆线 虫模式生物的优势使研究人员能够利用该系统获得大样本量的可重复数据。这些分析的见解可以转化为神经退行性疾病治疗干预的新靶点。

引言

兴奋性毒性是脑缺血中神经元死亡的主要原因，也是多种神经退行性疾病的促成因素 1,2,3,4,5,6,7,8,9。流向大脑的含氧血流中断（例如，由于血凝块）导致谷氨酸转运蛋白功能障碍，导致谷氨酸在突触中积累。这种过量的谷氨酸过度激活突触后谷氨酸受体 （GluR），导致 Ca2+ 过量（催化、非化学计量）流入神经元（图 1A）。这种有害的流入导致进行性突触后神经变性，其形态和机制范围从细胞凋亡到调节坏死 10,11,12。尽管它们基于动物模型中的成功干预，但试图阻断 Ca2+ 进入并促进细胞活力的 GluR 拮抗剂的多项临床试验在临床环境中失败了 13,14,15,16。这些失败的一个可能关键因素是（与动物模型相反）临床环境中的治疗是在中风发作后数小时进行的，导致干预阻断了迟发性神经保护机制，同时未能中断 GluRs 下游的退行性信号传导 14,16,17.另一种基于溶栓的方法只能在严格限制的时间窗口内进行，这使得许多患者（在家中中风，发病时间难以识别）无法从中受益17。这些挫折强调了将兴奋性毒性研究重点放在研究 GluR 过度刺激后发生的事件上的必要性，并将随后的退行性级联反应与并发的神经保护过程区分开来。这种方法可以帮助防止细胞损伤并确定可在损伤发生后稍后给药的有效药物靶点。

识别兴奋性毒性后续事件的一种方法是研究 GluR 过度刺激下游的细胞死亡信号机制，例如导致线粒体崩溃的机制。线粒体生理学和动力学的剧烈功能障碍是神经退行性的标志，如兴奋性毒性 18,19,20 所示。虽然所有细胞都依赖于线粒体功能和生存、活动和细胞维持的可用性，但神经元特别依赖线粒体能量的产生来支持信号传输和传播。具体来说，神经元在突触后受体/通道激活后花费 ~50% 的信号相关能量消耗来恢复静息膜电位21，高度依赖氧和葡萄糖。在中风中观察到的葡萄糖和氧气可用性降低导致严重的线粒体改变，导致 ATP 产生进一步减少 19,22,23,24。然而，确定导致线粒体崩溃的事件序列的研究产生了有争议的结果，并且缺乏共识。分析线粒体形态可以帮助了解这些导致线粒体病理的事件，因为它是神经元健康的一个很好的指标 25,26,27,28,29。丝状线粒体代表健康神经元，而碎片化线粒体揭示了可能导致细胞死亡的大量神经元损伤。分析不同遗传条件下活体动物的线粒体形态有助于关注兴奋性毒性中线粒体依赖性神经变性所涉及的特定基因和通路。

另一种识别可能调节兴奋性毒性神经变性程度的后续事件的方法是研究减轻兴奋性毒性部分影响的转录神经保护机制14,16。然而，关键神经保护转录因子缺乏特异性和实验设置的差异阻碍了明确识别核心神经保护程序（尤其是在调节坏死中）的努力取得成功。

因此，下游死亡信号通路的研究和兴奋性毒性中转录神经保护的研究都遇到了很大的困难和对观察到的结果的分歧。这种争议的大部分可能来自兴奋性毒性的离体或体外模型的使用，以及不同实验设置的特异性引入的可变性。因此，专注于识别高度保守的核心机制并在体内研究它们是非常有益的。线虫秀丽隐杆线虫的简单模型系统提供了一个特别有效的选择，因为它特别强大和多样化的研究工具的有效组合，核心细胞死亡途径的保守性，以及关于其神经系统结构和连接的丰富信息 30,31,32,33.事实上，Driscoll 实验室在机械感觉神经元中坏死性神经变性遗传分析方面的开创性工作很好地证明了这种方法的力量34。对于兴奋性毒性的分析重要的是，线虫中信号通路的保守性包括谷氨酸能神经传递的所有主要成分35,36。

线虫兴奋性毒性模型建立在这些开创性研究的基础上，使研究人员能够研究类似于中风和其他受谷氨酸依赖性神经毒性影响的神经退行性疾病中发生的生化过程。为了在秀丽隐杆线虫中诱导兴奋性毒性条件，这种实验方法使用兴奋性毒性菌株，该菌株是谷氨酸转运蛋白基因 （glt-3） 的敲除和神经元致敏遗传背景 （nuls5 [Pglr-1：：GαS（Q227L）]） 的组合，以产生 GluR 过度刺激和神经变性37。这种兴奋性毒性菌株暴露了 30 个特异性 （glr-1 表达） 神经元，这些神经元位于突触后谷氨酸能连接到兴奋性毒性神经变性。在这 30 个高危神经元中，单个神经元随着动物的发育进展而发生坏死（具有混合随机性和对某些特定神经元的部分偏好38），同时细胞尸体也逐渐被移除。结合许多突变菌株的可及性，这种方法允许研究影响神经退行性和神经保护的多种途径。这些方法已经用于分析兴奋性毒性中兴奋性神经变性的一些下游死亡信号级联39 和转录调节因子38,40。与蠕虫41 中的其他坏死性神经变性病例一样，线虫的兴奋性毒性神经变性不涉及经典细胞凋亡40。

本方法论文描述了诱导、量化和纵 秀丽隐杆线 虫兴奋性毒性坏死神经变性的基本系统。此外，它概述了目前用于简化线虫兴奋性毒性特定方面的研究的两种主要方案。通过使用荧光报告基因和活体成像，研究人员可以研究兴奋性毒性神经变性线虫模型中的线粒体参与和动力学。为了确定特定神经保护性转录因子的作用，研究者可以使用荧光标志物的细胞类型特异性表达、动物解离成单细胞和 FACS 来分离因兴奋性毒性而有坏死风险的特定神经元。然后，这些细胞类型特异性分离的神经元可用于携带关键转录因子突变的菌株的 RNA 测序。综上所述，这些方法可以使研究人员非常清晰和精确地梳理出体内兴奋性毒性神经变性和神经保护的分子基础。

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研究方案

1. 用于研究兴奋毒性神经退化和神经保护的菌株

  1. 使用线虫兴奋性毒性菌株 ZB1102 作为标准兴奋性毒性神经变性的参考点。
    注： 秀丽隐 杆线虫中的谷氨酸依赖性兴奋性毒性是在菌株 ZB1102 中通过结合谷氨酸转运蛋白的敲除 （ko） 与使这些动物中的神经元对神经毒性敏感的转基因产生的，并在突触后谷氨酸能连接的神经元子集中表达37。这种遗传组合被称为线虫兴奋性毒性菌株，可从 Caenorhabditis 遗传学中心 （CGC） 免费获得。
  2. 为了研究编码兴奋性毒性坏死的候选调节因子的基因的作用，将此类基因的突变（例如， dapk-1 或 crh-1）与线虫兴奋性毒性菌株相结合。
  3. 根据标准秀丽隐杆线虫方法30 进行遗传杂交，如 wormbook.org42,43 中所述。
  4. 由于突变的分子基础通常被记录下来，因此通过使用 PCR 对特定基因座进行基因分型来跟踪交叉后代。通过片段大小（用于缺失）或测序（用于点突变）区分 WT 与突变体。
    注意： 表 1 概述了用于研究神经退行性和神经保护的不同途径的菌株，特别是针对该方案。
  5. 通过两条独立的线得出所有关键菌株，并分别测试它们以确认观察到的表型的有效性。

2. 生长培养基和畜牧业

  1. 根据标准方法，在 16-25 °C 下在标准 NGM 板 30,37,42 或 MYOB 板 38,44 上培养蠕虫，这些板用 OP50 大肠杆菌接种。
    注意：MYOB 板给出的结果与 NGM 板相同，但准备稍微容易一些。
  2. 保持实验菌株始终如一地良好喂养。
    注意：饥饿会影响神经退行性变并减少垂死的头部神经元的数量。如果蠕虫喂养不良或饥饿，请将它们接种在新鲜的平板上，等待几代后再继续实验。饥饿的跨代影响将在几代后减弱。

3. 通过 Nomarski 微分干涉对比 （DIC） 定量退化头部神经元并进行评分

  1. 使用线虫兴奋性毒性菌株 （ZB1102： glt-3（bz34） IV; nuIs5 V） 作为定量的实验对照，代表正常的兴奋性毒性水平。该协议不会跟踪同一只动物经历不同的发育阶段。相反，它给出了混合阶段动物种群的快照，因此总共从不同的动物那里收集信息来代表所有发育阶段。
    注： nuls5 转基因 [Pglr-1：：GαS（Q227L）。Pglr-1：：GFP]45 （在突触后到谷氨酸能连接的神经元中表达激活的 Gαs 和 GFP）产生 ~1 个垂死头部神经元/动物的背景 GluR 非依赖性坏死神经变性水平（在发育过程中的任何给定时间）。 glt-3 （ko） 的添加以 GluR 依赖性方式增加突触后表达 nuIs5 的神经元的坏死神经变性，在第三幼虫阶段 （L3） 增加到 4-5 个垂死的头部神经元/动物37。
  2. 对于测试菌株，使用来自最近完成的基因杂交的动物，或从 -80 °C 冷冻原液中解冻由新鲜杂交制备的目标菌株。等待几代 （≥4） 后再对表型和神经退行性变进行评分。
  3. 从混合阶段喂养良好的动物种群的平板上切下一小块琼脂，然后通过将琼脂块翻转过来将其固定在盖玻片上，这样在琼脂表面爬行的动物现在面对盖玻片。
    注意：动物仍然可以移动，但现在受到一定程度的约束，可以在没有麻醉的情况下进行观察。这样的块可以使用~1小时，然后再用新的块替换它。
  4. 使用带有 x10 目镜和 x40 或 x63 物镜的倒置 DIC 瞄准镜，通过手动滑动盖玻片随机扫描动物。虽然下面描述的其他成像步骤可以在倒置或正置显微镜上进行，但琼脂块中蠕虫的检查需要倒置显微镜。
  5. 通过子宫的形状确定每只动物的发育阶段（参见 wormbook.org 中的子宫图）。
  6. 对于每种动物，记录其发育阶段和垂死（即空泡）神经元的数量。计数并记录头部中垂死神经元的总数，囊泡后神经节中垂死神经元的数量（这很容易识别特定细胞），以及尾部垂死神经元的数量（不受谷氨酸影响，作为内部对照，确认致敏转基因 nuIs5 完全活跃）。
  7. 将此数据记录在一个表格中，其中来自给定品系的动物按发育阶段的类别分组。
  8. 在每次会话中，从几个发育阶段的蠕虫中随机收集数据;在多天内执行多次评分会话，以收集足够的数据进行统计分析。记录多个阶段的神经退行性变水平，并构建类似于 图 1C 的条形图。
    注意：这种方法将允许人们确定某种治疗或突变是否在所有阶段提高/降低神经退行性变水平（上/下移动分布）或将神经退行性变的峰值转移到早期或晚期发育阶段（左/右移动分布）。
  9. 在对基因型的身份不知情的情况下进行数据收集。在遗传系的两个独立分离株中确认（以尽量减少分离株之间其他/意外遗传差异的意外影响的危险），并汇集数据进行分析。
  10. 在每种菌株中，计算每个发育阶段头部（包括囊泡后神经节）退化神经元数量的平均值和 SEM（图 1D）。根据需要对垂死的囊泡后神经节和尾部神经元进行类似的分析。

4. 鉴定特异性退化头部神经元

  1. 将单个（或一小群）动物安装在琼脂垫46 上，并用四咪唑麻痹蠕虫（见下文，第 5 节）。
  2. 使用荧光和 DIC 范围（正置或倒置）的组合定位特定的空泡神经元。
  3. 通过使用 WormAtlas47 跟踪其 GFP 标记的过程并将细胞体的位置和过程的形状与已知表达 glr-1 的神经元的位置进行比较，确定空泡神经元的特定神经元身份。
    注意：或者，可以通过 Hobert 实验室即将推出的新方法辅助识别，通过多色标记快速识别神经元48。

5. 通过报告菌株的荧光显微镜对神经元线粒体形态进行实时成像

  1. 对于退化的突触后神经元（在原始兴奋性毒性菌株中用细胞质 GFP 标记）中线粒体变化的成像，请检查 mito-mCherry 荧光。
  2. 将测试兴奋性毒性菌株与用红色荧光标记突触后神经元线粒体的菌株杂交（通过在 glr-1 启动子下表达荧光蛋白和 TOM-20 的 N 末端之间的融合;有关构建体和菌株的详细信息，请参见49）。现在可以使用常规落射荧光显微镜（正置或倒置）或共聚焦显微镜对动物进行成像。
  3. 为了在不影响神经元存活的情况下麻痹蠕虫，将 5 μL 的 10 mM 四咪唑移液到新鲜制备的琼脂糖垫上。有关 Pad 制备的详细方案，请参见 Arnold 等人 46 。
  4. 将动物放在四咪唑液滴的中心，并用盖玻片安装。
  5. 用指甲油密封盖玻片的侧面，让指甲油干燥。
  6. 在四咪唑治疗后 20 分钟内，使用具有 DIC 和荧光成像功能的内窥镜，使用 20 倍物镜定位蠕虫。
  7. 一旦找到蠕虫的头部（或感兴趣的神经元），就移动到 100 倍油物镜，并专注于体细胞中线粒体的荧光标记。
  8. 使用 DIC、GFP 和 TxRed 滤镜设置捕捉 Z 堆栈图像。

6. 神经元线粒体形态评分和定量

  1. 在蠕虫实时成像期间或使用 ImageJ 或其他成像软件采集图像后分析线粒体形态。
  2. 为了便于识别和重复分析特定神经元，鉴定水泡后神经节中的三个神经元，RIGL/R 和 AVG（在某些情况下，由于兴奋性毒性中的细胞尸体清除，仅存在两个神经元）。
  3. 将线粒体分为三大类：丝状、中间和碎片化 50,51,52。
    注意：丝状线粒体在神经元的胞体中表现为连续的薄结构，通常围绕着细胞核。中间线粒体表现为至少一个明显的丝状网络的组合，尽管在体细胞中有一些断裂和一些碎片。碎片化的线粒体在线粒体网络中表现出完全断裂，外观肿胀，并散布在整个胞体中（图 2A）。
  4. 对于每个蠕虫，对总共至少 30 条蠕虫的丝状、中间或碎片化线粒体的神经元百分比进行评分。
  5. 使用单向方差分析进行统计分析，然后对菌株之间的每个线粒体形态进行事后 Tukey 检验53。

7. 用于有神经退行性变风险的神经元 FACS 蠕虫解离的缓冲液和试剂制备

  1. 按如下方式制备 M9 缓冲液：3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4,5 g NaCl，H2O 至 1 L。通过高压灭菌灭菌。加入 1 mL 过滤灭菌的 1 M MgSO4。在室温下储存。
  2. 按如下方式制备鸡蛋缓冲液：118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2 ;高压灭菌器灭菌。加入 2 M HEPES pH 7.3 储备溶液（之前用 0.2 μm 瓶顶过滤器过滤）至终浓度为 25 mM。用 1 N NaOH（不超过 10 mL）将 pH 调节至 7.3。使用渗透压计确保最终渗透压在 335 -345 mOsm 之间。用 0.2 μm 瓶顶过滤器过滤消毒鸡蛋缓冲液。储存在 4 °C 中。
    注：当使用 MgCl2 ·6H2O 和 CaCl2·2H2O 制备相应的 MgCl2 和 CaCl2 储备溶液时，盐更容易溶解。您也可以制备 10x 鸡蛋缓冲液的储备液，并在需要时用无菌去离子水稀释。
  3. 如下制备 SDS-DTT：20 mM HEPES pH 8.0、0.25% SDS、200 mM DTT、3% 蔗糖。在组织培养罩中，用 0.2 μm 注射器过滤器对 SDS-DTT 进行消毒。将 300 μL 等分试样储存在 -20 °C 中，并盖上铝箔以避光。
  4. 如下制备链霉蛋白酶溶液：在鸡蛋缓冲液中制备解离当天的 15 mg/mL 链霉蛋白酶。储存在冰上。

8. 神经元特异性 FACS 的年龄同步

  1. 使用将兴奋性毒性基因型（和其他突变，根据需要）与易于用于分选的强荧光标记物的转基因表达相结合的动物（例如，FJ1244： pzIs29 [Pglr-1：：NLS：：LAC-Z：：GFP：：glr-1 3'UTR] X）54。在20°C下在两个或三个100mm NGM / MYOB板上培养动物，直到板中充满了主要是妊娠的蠕虫。
  2. 使用 M9 缓冲液从板上洗掉蠕虫。使用 10 mL 玻璃血清移液管将蠕虫转移到 50 mL 锥形管中。
  3. 在室温下以 250 x g 离心 2.5 分钟，并去除上清液。
  4. 将蠕虫沉淀重悬于 10 mL 漂白剂溶液（2% 10 N NaOH 和 5% 新鲜家用漂白剂，溶于无菌去离子水中）。
  5. 将试管水平放在摇床上，低速摇动。确保蠕虫不会沉降到试管底部。漂白剂会裂开蠕虫的角质层，但不会影响胚胎，胚胎受到蛋壳的保护。
    1. 此漂白步骤大约需要 5 分钟，但具体时间会有所不同。为确保不会发生过度漂白，请通过每分钟取取一份样品来监控过程：从玻璃显微镜载玻片上的每个试管中轻轻吸取 10 μL，并使用解剖显微镜检查蠕虫。
  6. 一旦大多数怀孕的蠕虫裂开但未完全溶解，通过用鸡蛋缓冲液填充锥形管来停止漂白步骤。
  7. 为了取回鸡蛋/胚胎，将试管以 250x g 离心 2.5 分钟，去除上清液并再次用鸡蛋缓冲液洗涤。
  8. 再重复四次洗涤。
  9. 通过轻轻移液沉淀重悬鸡蛋，并铺在四个 100 mm 种子 NGM/MYOB 板上。让胚胎在 20 °C 下孵化并生长 3 天。
    注意：板现在应该充满了主要是妊娠蠕虫。
  10. 通过重复此 bleach/age 同步协议来重复年龄同步。
  11. 将鸡蛋移液到八个 100 mm NGM/MYOB 板上。让动物在 20 °C 下孵化和生长，直到达到所需的幼虫阶段。

9. FACS 的全蠕虫细胞解离

  1. 将同步蠕虫生长到所需的发育阶段。用 M9 缓冲液和玻璃血清移液管轻轻洗去 100 mm 板，然后转移至 50 mL 锥形管中。
  2. 添加冷 M9 至 45 mL。将试管放在冰上 30 分钟，让蠕虫在重力作用下沉降在底部，而平板上残留的任何细菌碎片都会漂浮在上清液中。
  3. 去除上清液，用新鲜的 M9 洗涤蠕虫。
  4. 重复 30 分钟的重力沉降在冰上。
  5. 去除上清液，加入 M9 至 45 mL，并以 250 x g 离心 5 分钟。
  6. 将沉淀转移到微量离心管中，并添加 M9 至 1 mL。
  7. 在台式离心机上以 14,000 rpm 离心 1 分钟，然后去除上清液。
  8. 为了破坏角质层，用 SDS-DTT 重悬蠕虫沉淀，使用（大约）两倍体积的颗粒，并在室温下摇动孵育 4 分钟，用于 L2 成体阶段。
    注：在 SDS-DTT 中孵育时间不要超过 4 分钟，因为荧光蛋白信号会随着 SDS-DTT 处理时间的延长而急剧减弱。由于 SDS-DTT 对光敏感，因此其使用时间不应超过 3 个月，因为溶液可能会随着时间的推移而失去效力;解离与最近制备的 SDS-DTT 溶液配合使用效果最佳。
  9. 加入 1x 鸡蛋缓冲液 （pH 7.3， 335-345 mOsm） 至 1 mL 以停止 SDS-DTT 处理。
  10. 在台式离心机上以 14,000 rpm 离心 1 分钟，然后去除上清液。
  11. 为了进一步破坏角质层并解离动物的细胞，用室温链霉蛋白酶溶液重悬沉淀，使用沉淀体积的三倍。
  12. 在室温下孵育 15-30 分钟。
  13. 用 P-200 或 P-1000 移液器每 5 分钟上下移液 40 次，用移液枪头接触试管底部。
    注意：尖端接触管底时产生的压力有助于蠕虫解离。使用过滤嘴，这样蠕虫就不会在快速移液过程中意外进入移液器轴。
  14. 15 分钟后，通过在载玻片上轻轻移液 5 μL 并在解剖显微镜下观察进度来检查蠕虫解离的进度。当大多数 （~90%） 完整的蠕虫爆裂时，该过程就完成了。
    注：如果许多蠕虫保持完整，则可以延长链霉蛋白酶孵育时间。
  15. 在细胞培养罩中，加入 1x 鸡蛋缓冲液至 1.5 mL，以停止链霉蛋白酶处理。
  16. 转移到 FACS 管中，加入 5 mL 鸡蛋缓冲液，以 800 x g 离心 5 分钟。
  17. 去除上清液并重悬于 3 mL pf 鸡蛋缓冲液中。
  18. 将 70 μm 细胞过滤器盖放在新的 FACS 管上，将细胞悬液移液到过滤器上，并以 800 x g 旋转 1 分钟。收集外排细胞悬液。
  19. 将 5 μm 细胞过滤器盖在新的 FACS 管上，将细胞悬液移液到过滤器上，并以 800 x g 旋转 1 分钟。
  20. 在鸡蛋缓冲液中加入终浓度为 0.5 μg/mL 的 DAPI，置于冰上，盖上盖子/盖子避光。
  21. 尽快进行 FACS。荧光蛋白信号随着时间和光照而减弱，因此尽快执行解离方案并在解离完成后立即进行 FACS 非常重要。
    注意：蠕虫解离方案改编自 Miller 实验室 55,56,57、Murphy 实验室58 和 Shaham 实验室59 的方案。

10. 用于识别 秀丽隐杆线 虫神经元的 FACS 机器作修改

  1. 对 秀丽隐杆线 虫神经元进行分类时，使用 4 升冷冻 （4 °C） 鸡蛋缓冲液代替标准鞘液。
    注意： 秀丽隐杆 线虫细胞的渗透压远高于哺乳动物细胞，标准鞘液会使神经元破裂。所有的机器设置和校准都是在添加鸡蛋缓冲液后完成的，因为鸡蛋缓冲液的粘度与标准鞘液的粘度不同。分拣技术人员将通过机器运行诊断珠，以确保激光器正常工作。
  2. 当分选的神经元用于后续的转录组学研究时，将至少 100,000 个 GFP + 细胞直接分选到 800 μL Trizol-LS + 10 μL RNase 抑制剂中。
  3. 将细胞在 Trizol 中倒置 15 次以混合。
  4. 在干冰/乙醇浴中快速冷冻并储存在 -80 °C，直到准备好从所有样品中提取 RNA 以进行一次 RNA 测序实验。
    注：虽然大多数分选的细胞直接收集到 Trizol 中进行转录组分析，但请确保检索收集到鸡蛋缓冲液中的 GFP + 分选细胞（来自每个菌株）的小样本，以便对分选效率进行显微镜验证。

11.FACS选通策略

  1. 为了识别 GFP 阳性信号，请使用带有 530/30 滤光片和 502 长通 （LP） 的 488 nm 激光器。
  2. 为了识别 DAPI 阳性和阴性细胞，请使用带有 450/50 滤光片的 405 nm 激光器。
  3. 为了识别可能被误认为是 GFP 阳性细胞的自发荧光细胞，请使用带有 610/20 滤光片和 595 LP 的 488 nm 激光器（个人通信，洛克菲勒大学流式细胞术资源中心运营经理 Stanka Semova）。
  4. 执行标准设门策略并删除具有大侧向散射区 （SSC-A） 和小前向散射区 （FSC-A） 的事件，这些事件可能代表细胞和碎片的团块。
  5. 隔离前言 scatter 单峰，然后隔离侧 scatter 单峰。
  6. 分离具有高 GFP 信号和低自发荧光信号的细胞。
    注：自发荧光高而 GFP 低的细胞不是真正的 GFP 阳性细胞。
  7. 通过比较 GFP - 细胞（即 N2）与 GFP + 细胞来确定 GFP + 门的阈值55,56。
  8. 根据 DAPI 对死细胞的选择性渗透性，去除任何具有活/死门的死细胞：通过将未染色的细胞与 DAPI 染色的细胞进行比较来确定活死门的阈值。
    注：分选多个样品时，冲洗样品之间的液流，以确保没有交叉污染。

12. 分选神经元的显微镜检查以验证 FACS 门控策略的效率

  1. 用液体驱避笔在玻璃显微镜载玻片上画一个圆圈。
  2. 移液 10 μL 分选细胞悬浮液在圆圈内的鸡蛋缓冲液中。将盖玻片盖在样品上，并在盖玻片的周边用指甲油密封。
  3. 指甲油干燥后，在正置/倒置荧光显微镜下检查分选的细胞确实主要是 GFP + 细胞。
    注意：在每次排序会话后执行此检查，以验证 FACS 门控策略57。

13. 在质量控制自动电泳系统上进行 RNA 提取和 RNA 质量定量

注：所有 RNA 工作都应格外小心，以避免被 RNase 污染（包括仔细准备试剂、耗材和最佳 RNase 安全实践）。

注：在通风橱中执行样品中含有苯酚和/或氯仿的所有步骤。

  1. 在室温下在 Trizol 中解冻小瓶细胞。
  2. 使用过滤吸头 P200 移液器吸头，上下移液数次以使样品均质化。
  3. 在室温下孵育 5 分钟。
  4. 每 1 mL 用于裂解的 Trizol 试剂中加入 0.2 mL 氯仿，然后盖紧试管。
  5. 倒置试管 15 次，孵育 （20-25 °C） 2-3 分钟。
  6. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心样品 15 分钟。 混合物分离成下层红色苯酚-氯仿、间相和无色上层水相。
  7. 专门收集含有 RNA 的上层水相，并转移到新的低 DNA/RNA 结合 1.5 mL 试管中。
    注：在某些情况下，如果鸡蛋缓冲液中从细胞分选仪中脱落到 Trizol 中的细胞比例大于 1：3 样品：Trizol-LS 比率，则鸡蛋缓冲液的高盐含量会导致蛋层倒置;如果发生这种情况，请添加更多的 Trizol-LS 并重复倒置和离心。如果您注意到分选后样品量的增加，也可以避免这种情况;如果未保持 1：3 的比例，请在开始 RNA 提取之前添加足够的 trizol。
  8. 为了进一步纯化 RNA，请使用 RNA 提取柱化学。
  9. 使用 Quality Control 自动电泳系统测量 RNA 完整性值 （RIN） 并确认 RNA RIN 为 8.0 或更高，以便输入到后续的 RNA 测序实验中。

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结果

兴奋性毒性的线虫模型和空泡退化神经元的鉴定
此处显示的数据转载自以前的出版物37,38。为了模拟兴奋性毒性诱导的神经变性，将谷氨酸转运蛋白基因敲除 （glt-3） 与神经元致敏转基因背景 （nuls5 [Pglr-1：：GαS（Q227L）;Pglr-1：：GFP）]） 中。转基因构建体在表达 GLut...

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讨论

虽然普遍的争议和失败表明兴奋性毒性是一个非常难以破译的过程，但对线虫兴奋性毒性的分析提供了一种特别有吸引力的策略，可以阐明这种关键形式的神经退行性变中保守的神经元细胞死亡途径。研究者可以依赖该系统中可用的丰富研究工具集合，特别是动物的透明度（允许体内分析）和大量活的突变体（可从 CGC 免费获得或通过 EMS 诱变和 CRISPR 等技术在内部制备）...

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披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

我们感谢 Mano Lab 和 Li 实验室（现任和近期）的所有成员提供的帮助和支持。我们感谢 Monica Driscoll 博士（罗格斯大学）开创了线虫坏死神经变性的分析并提供持续支持;Chris Li 博士 （CCNY） 提供支持和建议;Jeffery Walker（CCNY 流式细胞术核心设施）、Bao Voung 博士 （CCNY） 和 Stanka Semova（洛克菲勒大学分选学院核心）提供细胞分选的实际支持和建议;Chris Rongo 博士（罗格斯大学）负责试剂;Drs. David Miller （Vanderbilt Univ.）， Coleen Murphy （Princeton Univ.）， Shai Shaham， Menachem Katz， & Katherine Varandas（三人都来自洛克菲勒大学）。用于秀丽隐杆线虫解离方案。

Mano 实验室获得了 NIH NINDS（NS096687、NS098350、NS116028）和 NIH U54 CCNY-MSKCC 合作伙伴关系 （CA132378/CA137788） 的资助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
BleachAny household
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
CholesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Dry iceUnited City Ice Cube
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Ethanol (100%)VWREM-EX0276-1S
Ethanol (90%)VWRBDH1160-4LP
FACS tubesUSA Sci1450-2810
Filter tips USA Sci1126-7810
Glass 10 mL serological pipettes USA Sci1071-0810
Heating block BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Immersion Oil - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
IsopropanolVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL tubesUSA Sci4043-1021
Metamorph Imaging SoftwareMolecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
Microscope, Confocal, for Fluorescence ImagingZeissLSM 880
Microscope, Inverted, for Fluorescence ImagingZeissAxiovert 200 M
Microscope  CameraQ-ImagingRetiga R1
Microscope Light Source for Fluorescence ImagingLumencorSOLA SE Light Engine
Microscope, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Microscope, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri dishes, 100mmFisher SciFB0875712
Petri dishes, 60mmTriTechT3308
Pipet ControllerTEquipmentP2002
Pipettor P10 TipsUSA Sci1110-3000
Pipettor P1000 TipsUSA Sci1111-2020
Pipettor P200 TipsUSA Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse away sprayFisher Sci7000TS1
RNAse free serological pipettesUSA Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tubesUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomycin sulfateSigmaS6501-100G
SucroseVWRAAJ63662-AP
SUPERase·in RNase inhibitorFisher SciAM2694
Quality Control automated electrophoresis system: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent5067-5581 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - IKA vortexer adaptor at 2000 rpm Agilent/IKA3428000
Tapestation - Loading tips Agilent5067- 5152 or 5067- 5153
Tapestation - Optical Cap 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optical Tube 8x StripAgilent401428
Quality Control automated electrophoresis system: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris baseFisher SciBP152-500
Tris hydrochlorideFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure OsmometerFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP DispenserVWR25485-003

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