使用单卵母细胞记者测定在体外成熟期间的母体 mRNA 翻译程序

摘要

该协议描述了记者在体外成熟期间研究单卵母细胞 mRNA 翻译的调节。

摘要

与卵母细胞核成熟有关的事件已经很好地描述了。然而，对于细胞质中为受精和获得托蒂能做准备而发生的分子通路和过程，人们所知甚少。在卵母细胞成熟期间，基因表达的变化完全取决于母体信使RNA（mRNA）的转化和降解，而不是转录。因此，实施转化计划对建立卵母细胞发育能力以维持胚胎发育起着关键作用。本文是重点定义母体mRNA翻译程序的一部分，该程序发生在母体成熟和卵母细胞到卵母细胞的过渡阶段。在本方法论文中，提出了研究 体外 卵母细胞成熟期间目标mRNA翻译的调控策略。在这里，一个Ypet记者被融合到利益基因的3'未翻译区域（UTR），然后微注入卵母细胞与多基化mRNA编码为mCherry控制注射量。通过使用延时显微镜测量记者的积累，在卵母细胞成熟期间，在不同的过渡中计算翻译率。在这里，使用Ypet/插话-7（IL-7）-3'UTR记者为例，描述了卵母细胞分离和注射、延时记录和数据分析的协议。

引言

一个完全生长的哺乳动物卵母细胞在准备受精和获得托蒂波特时经历了快速变化。这些变化对于受精后维持胚胎发育至关重要。虽然与核成熟相关的事件描述得相对较好，但关于卵母细胞细胞质中的分子过程和通路的了解却要少得多。在卵母细胞成熟期的最后阶段，卵母细胞是转录沉默的，基因表达完全依赖于mRNA的转化和降解^1，2。因此，蛋白质的合成对发育能力至关重要，它依赖于在卵母细胞生长^1、3早期合成的长寿mRNA的定时翻译程序。作为确定母体mRNA翻译程序的一部分，在母细胞成熟和卵母细胞到卵母细胞的过渡期间执行，本文提出了一个策略，研究在体外美化成熟期间单卵母mRNA在单卵母细胞中的活化和抑制。

在这种方法中，YPet开读帧被克隆到3'UTR的感兴趣成绩单上游。接下来，mRNA编码本报记者是微注入卵母细胞与多基化mRNA编码mCherry控制注射量。使用延时显微镜 测量体外 卵母细胞成熟期间的记者积累。黄色荧光蛋白 （YFP） 和 mCherry 的积累记录在单个卵母细胞中，YFP 信号通过共同注入的 mCherry 的稳定水平进行校正。数据采集后，通过计算曲线拟合获得的曲线斜率， 计算体外 卵母细胞成熟期间的不同时间间隔的翻译率。

此方法提供了一个工具，以实验性地确认所选内源 mRNA 的翻译更改。此外，该方法还通过操纵目标 mRNA 4、5、6 的 3' UTR 的 cis-监管元素，促进控制卵母细胞成熟期间翻译的监管元素的定性。操纵多（A）尾长度也允许洞察腺酶/死细胞5^的活动。cis-代理元素或RNA免疫沉淀的突变可用于研究与同位素RNA结合蛋白^6，7的相互作用。此外，该方法还可用于通过测量与卵母细胞质量下降^8、9、10相关的模型中的目标 3' UTR 翻译来识别对卵母细胞发育能力至关重要的翻译程序的基本组件。本方法论文提出了一个具有代表性的实验，其中21天大的C57/BL6小鼠的卵母细胞被微注射与IL-7的3'UTR融合的Ypet记者。介绍了卵母细胞注射、延时记录和数据分析的设置和协议。

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研究方案

涉及动物的实验程序得到了旧金山加州大学动物护理和使用委员会（AN182026号协议）的批准。

1. 媒体准备

1. 添加表 1中描述的所有组件，使基本的卵母细胞收集介质和卵母细胞成熟介质。对于基本的收集介质，将 pH 设置为 7.4。对于收集和成熟介质，在使用当天添加 3 毫克/mL 的牛血清白蛋白 （BSA） 和 1 μM 西洛酰胺。

2. 为 Ypet-3' UTR 和 M 樱桃准备 mRNA 编码

1. 获取感兴趣的 mRNA 的 3+ UTR 序列。
   注:对于这项研究，序列以前是从小鼠卵母细胞cDNA获得的。
2. 设计引物，以放大目标 3' UTR 从卵母细胞 cDNA 和部分 pcDNA 3.1 向量包含 Ypet 编码序列，V5-epitope 标签和 T7 促进器。
3. 使用高保真DNA聚合酶试剂盒放大。在凝胶上运行聚合酶链反应 （PCR） 产品，以检查碎片是否有正确的尺寸，切出带子，并根据制造商的说明使用凝胶提取套件从凝胶中提取 DNA。
4. 使用 PCR 克隆套件将 PCR 片段融合到向量中。
   注:PCR碎片在冰上孵育4小时，以促进更高效的重组过程。这与制造商的说明相反，制造商建议的孵化时间仅为 45 分钟。
5. 将 PCR 片段传输到合格 的 5-α 大肠杆菌 。
   1. 将混合物和质粒加入细菌中，在冰上孵育30分钟。
   2. 将混合物放入42°C的水浴中加热45秒，并立即在冰上冷却3分钟，从而冲击混合物和质粒。
   3. 添加 500 μL 的超级最佳肉汤与卡塔博利特抑制 （SOC） 介质和孵育 1 小时在 37 °C.
   4. 在 7000 × g 下旋转 2 分钟，并去除大部分超自然。用适当的选择抗生素在卢里亚兄弟 （LB） agar 板上重新喷射和板。
      注:卡贝尼西林在这项研究中使用。
   5. 在37°C的夜间孵化。 通过轻轻按压其中一个殖民地的移液器尖端，并将其放置在 3 毫升的 LB 介质中，并配有 100μg/mL 的苯甲酸酯，从而隔离殖民地。在 37 °C 时孵化 12-24 小时。
   6. 根据制造商的说明，使用质粒DNA分离套件提取质粒的DNA，并通过DNA测序确认序列。
6. 对于伊佩特/3' UTR:
   1. 生成用于体外转录的线性 PCR 模板。使用 Ypet 序列上游的前进引物和带有 20 个额外胸腺残留物的反向引物。有关 Ypet/IL-7 3' UTR 的序列以及前进和反向引物的序列，请参阅表 2。
      注意:这些额外的胸腺残留物 将在体外转录后将寡头（A）添加到线性mRNA中。
   2. 体外 根据制造商的说明使用 T7 转录套件转录 PCR 产品。
   3. 根据制造商的说明，使用转录清理套件净化由此产生的互补RNA （cRNA）。
   4. 在无RNASe水中清除纯化的cRNA，测量浓度，并通过糖电泳评估完整性。储存在−80°C。
7. 对于樱桃:
   1. 使用高保真度限制酶生产 用于体外 转录的线性 PCR 模板;如果复制此示例，请使用限制酶 mfEI-HF。在37°C的消化缓冲区中消化过夜。
   2. 运行凝胶来净化样品，并根据制造商的说明使用凝胶提取套件提取线性DNA。
   3. 体外 根据制造商的说明使用 T7 转录套件转录 PCR 产品。
   4. 根据制造商的说明，使用聚（A）尾矿套件对 cRNA （150-200 核苷酸） 进行聚聚苯乙烯酸化。
   5. 根据制造商的说明，使用转录清理套件净化由此产生的 cRNA。
   6. 在无RNASe水中清除纯化的cRNA，测量mRNA浓度，并通过凝胶电泳评估消息完整性。储存在−80°C。

3. 实验程序

注: 图1中给出了卵母细胞微注射和随后延时显微镜的示意图概述。

1. 第 1 天
   1. 在腹腔内给21天大的老鼠注射5IU的怀孕母马血清性腺激素，以促进卵泡生长到蚂蚁期^11。
2. 第3天
   1. 卵母细胞集合
      1. 牺牲小鼠44-48小时后，启动收集卵巢，并把它们放在一个塑料培养皿与基本的卵母细胞收集介质。
      2. 小心地打开心角毛囊，用26G针在毛囊壁上做一个小切口。使用口腔操作的玻璃移液器，将完整的积聚封闭卵母细胞 （COCs） 与几层积聚细胞分离。
      3. 使用较小的移液器（略大于卵母细胞的直径），并通过重复的管道反复机械地去除 COC。
         注:或者，对完好无损的 COC 进行微注射。
      4. 使用更大的移液器，吸气凹陷的卵母细胞，并把它们放在一个培养皿与成熟介质补充1μM的磷柴油酶抑制剂，西洛斯塔米德，以防止恢复美化成熟^12。将菜放在孵化器中2小时，让卵母细胞从卵泡中分离卵母细胞所引起的压力中恢复过来。
   2. 卵母细胞微注射
      1. 将10厘米长的薄膜玻璃毛细管放入机械拉力器中，准备注射针头。为了获得最佳注射效果，请使用加热灯丝以 45° 角弯曲针尖。
      2. 用20μL基本卵母细胞收集介质液滴准备聚苯乙烯菜肴，用轻质矿物油覆盖液滴。
      3. 通过添加 12.5 微克/μL Ypet-3' UTR 和 12.5 微克/μL mCherry 来准备记者组合。准备更大的体积，并为未来的实验制作别名，以确保类似的记者浓度。将这些别名存储在-80°C。 解冻后，先在20，000 x g下将离心机离心机进行2分钟，并转移到新的微中线管中。
         注意:这种离心将防止注射针被记者组合中的潜在聚合物堵塞。
      4. 用毛细毛虫装载注射针，约0.5μL的记者混合。
      5. 将手持的移液器和加载的注射针放入支架中，并放置在卵母细胞收集介质的液滴中。将一些介质吸进手持式移液器中。
      6. 轻轻敲击注射针，使其贴在握住的移液器上，打开注射针。
      7. 将卵母细胞放在基本收集介质的液滴中，并注入5-10 pL的记者混合。
      8. 在成熟介质中用1μM西洛酰胺孵育卵母细胞16小时，使mCherry信号稳定下来。
      9. 准备一个培养皿，用于延时显微镜与至少两个20μL液滴的成熟介质为每个注射记者:一个液滴与1μM西洛酰胺控制前阶段I逮捕卵母细胞和一个液滴没有西洛酰胺成熟卵母细胞。用轻质矿物油盖住液滴，放在孵化器中。
   3. 延时显微镜
      1. 预孵化后，从孵化器中取出注射的卵母细胞，并在成熟介质中清洗四次，无氯酰胺。将一些卵母细胞保持在成熟介质中，以1μM西洛酰胺作为前阶段I-逮捕卵母细胞控制组。
      2. 将注射的卵母细胞转移到先前准备的延时显微镜盘上各自的液滴中。使用封闭的玻璃移液器将卵母细胞聚集在一起（封闭的移液器可以通过将尖端保持在火焰中几秒钟来准备）。
         注意:将卵母细胞聚集在一起有助于防止它们在录制过程中的移动。
      3. 将盘子放在显微镜下，配备发光二极管照明系统和配备环境室的电动舞台，保持在37°C和5%_{的二氧化碳}。要复制此研究，请使用以下参数:筛选器集:二色镜 YFP/CFP/m樱桃 69008BS;YFP 通道（激励（前）:S500/20 × 49057;排放（EM）:D535/30米47281）、M樱桃通道（前:580/25×49829:Em: 632/60m）。
      4. 输入延时实验的相应设置（参见本研究中使用的软件 材料表 ）:单击 应用|多维采集。选择第一个选项卡 主 选项卡并选择 延时、多个阶段位置和 多个波长。
      5. 选择" 保存 "选项卡以输入应保存实验的位置。
      6. 选择选项卡 延时 输入时间点、持续时间和时间间隔的数目。
         注:延时实验的持续时间取决于所研究的动物物种，因为卵母细胞成熟的时间因物种而异。在这个实验中，小鼠卵母细胞每15分钟记录一次，每次16小时。
      7. 选择选项卡 阶段。打开明亮的场，通过选择获取|打开新窗口，定位卵母细胞的位置 获取|显示现场。一旦卵母细胞被定位，切换回 多维采集 窗口，并按 + 设置卵母细胞的位置。
      8. 选择选项卡 波长，并为亮场设置 3 个不同的波长（曝光 15 毫秒）、YFP（Ypet/IL7 3' UTR 的曝光 150 ms）和 mCherry（Ypet/IL7 3' UTR 的曝光 75 毫秒）。
         注:根据记者积累水平和注射量调整每位Ypet/3'UTR记者的曝光率。确保 YFP 信号在实验开始时位于检测范围的中心，以防止在激活翻译时低估或饱和。对于 mCherry，调整每批 mCherry 的暴露，因为信号取决于聚苯乙烯化过程中添加的腺苷核苷酸的数量。由于聚苯乙烯化效率的变化，在不同的实验中使用同一批mCherry，以便更好地比较实验。
      9. 通过单击 "获取"开始时间推移实验。请参阅 图 2 和 补充文件 ，了解单个卵母细胞中延时记录的示例。
   4. Ypet-3'UTR 翻译分析
      1. 对于此分析（参见本研究中使用的软件 的材料表 ），为每个卵母细胞执行两个区域测量:卵母细胞本身-点击 椭圆区域 并环绕卵母细胞-和一个小区域靠近卵母细胞，用于背景减法-点击 矩形区域。
         注意:确保卵母细胞在延时记录期间不会移出选定的区域。特别注意极地体挤压周围区域测量的位置，因为这会导致卵母细胞运动，并可能扭曲记录。
      2. 首先单击 "打开日志"， 然后单击 日志数据 以导出数据分析软件，将区域测量数据导出到电子表格中。
      3. 对于每个单独的卵母细胞和所有测量的时间点，从卵母细胞区域测量中减去背景区域测量。分别针对YFP和m樱桃波长这样做。
      4. 记录细菌囊泡破裂 （GVBD） 和极地身体挤压 （PBE） 的时间，供以后参考。
         注意:当GVBD超过2小时时，排除成熟的鼠标卵母细胞。
      5. 绘制YFP和m樱桃表达随着时间的推移，每个卵母细胞检查离群值。
         注意:这应该是一个平滑的曲线，如果不是这样，这可能表明卵母细胞在录制过程中移动。
      6. 对于每个单独的卵母细胞，计算记录最后十个时间点的平均 mCherry 表达。对于每个时间点，将 YFP 表达按平均 mCherry 表达法进行除以以更正注入的体积，以便在每个每个卵母细胞的每个时间点获得 YFP/m 樱桃比。
      7. 通过线性回归来安装曲线的斜率，计算特定时间间隔的翻译率。使用统计推论评估翻译率的差异。

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结果

21天大C57/BL6小鼠的被否定的阶段I-逮捕卵母细胞被注射了含有mRNA编码的记者组合，将Ypet记者融合到IL-7的3'UTR和mRNA编码mCherry。YFP和mCherry表达记录在39个卵母细胞中，其中30个已经成熟，9个在序言I中作为负控制被捕。三个成熟的卵母细胞被排除在分析之外，因为它们要么有延迟的GVBD（N+2），要么在录制过程中在盘子里移动（N=1）。 图3 显示了M樱桃和YFP表达在第一阶段和成熟?...

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讨论

提出的方法描述了一种策略，研究在体外卵母细胞成熟期间不同过渡时对目标mRNA的活化和抑制。IL-7，一种细胞因子释放的卵母细胞，可能涉及卵母细胞-cumulus细胞通信^8，13，被选择用于描述这种方法。IL-7 在卵母细胞成熟⁸期间被越来越多地翻译，并且允许使用此方法对转化激活进行良好的可视化。但是，如果在整个实验中以恒?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra	Sigma-Aldrich	SIAL-A3311
Cilostamide	EMD Millipore	231085
MEM alpha	Gibco	12561-056
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered	Genesee Scientific Corporation (GenClone)	25-512
Sodium Bicarbonate	JT-Baker	3506-1
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
Agarose	Apex Biomedical	20-102QD
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C1389-1G
Choo-Choo Cloning Kit	McLab	CCK-20
CutSmart Buffer (10x)	New England Biolabs	B7204
DNA loading dye (6x)	Thermo Scientific	R0611
dNTP Solution	New England Biolabs	N0447S
DpnI	New England Biolabs	R0176
GeneRuler 1 kb DNA ladder	Thermo Fisher	SM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova	Teknova	L1010
LB Medium (Capsules)	MP Biomedicals	3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Life Technologies	AM1908
MfeI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit	Invitrogen	AM1344
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530
Poly(A) Tailing kit	Invitrogen	AM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
S.O.C. medium	Thermo Fisher	15544034
TAE buffer	Apex Biomedical	20-193
Ultrapure Ethidium Bromide Solution	Life Technologies	15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Calibrated micro-pipettes	Drummond Scientific Company	2-000-025
PMSG- 5000	Mybiosource	MBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2	BD	305111
Syringe 1 ml	BD	309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-0-20-C	For time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filament	Sutter Instrument	BF100-78-10
Oil for Embryo Culture	Irvine Scientific	9305
Petri Dish	Falcon	351006	For micro-injection
Tissue Culture Dish	Falcon	353001	For oocyte incubation
VacuTip Holding Capillary	Eppendorf	5195000036
Software
Biorender	BioRender		Preparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0	Molecular Devices		For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation