一种基于板的测定法，用于测量急性脑切片中内源性单胺释放

摘要

该方法引入了一种使用急性脑切片检测内源性单胺释放的简单技术。该装置使用含有组织支架的48孔板进行单胺释放。释放的单胺通过HPLC结合电化学检测进行分析。此外，该技术还为药物发现提供了一种筛选方法。

摘要

单胺类神经递质与许多神经系统和精神疾病有关。这些条件的动物模型已经显示出单胺神经递质释放和摄取动力学的改变。技术上复杂的方法，如电生理学，快速扫描循环伏安法（FSCV），成像，体内微透析，光遗传学或使用放射性是研究单胺功能所必需的。这里介绍的方法是一种优化的两步法，用于检测急性脑切片中的单胺释放，使用含有组织支架的48孔板来检测单胺释放，并使用高效液相色谱联用电化学检测（HPLC-ECD）进行单胺释放测量。简而言之，使用组织切片器或振动器获得包含感兴趣区域的大鼠脑切片，包括前额叶皮层，海马体和背纹状体。从整个大脑中解剖这些感兴趣的区域，并在含氧的生理缓冲液中孵育。在整个实验过程中，通过3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定法检查了活力。急性解剖的大脑区域在不同的药物条件下孵育，已知这些药物条件通过转运蛋白（苯丙胺）或通过活化胞细胞囊泡释放（KCl）诱导单胺释放。孵育后，收集上清液中释放的产物并通过HPLC-ECD系统进行分析。在这里，通过HPLC从急性脑切片中检测到基础单胺释放。该数据支持先前的体内和体外结果，表明AMPH和KCl诱导单胺释放。该方法对于研究与单胺转运蛋白依赖性释放相关的机制特别有用，并且提供了以快速和低成本的方式筛选影响单胺释放的化合物的机会。

引言

过多的神经系统和精神疾病与单胺类神经递质（多巴胺[DA]，5-羟色胺[5-HT]，去甲肾上腺素[NE]）稳态的失调或维持不足有关^1，2，3。这些疾病包括但不限于抑郁症^1，2，精神分裂症2，焦虑^症2，成瘾⁴，更年期^5，6，7，疼痛⁸和帕金森病³。例如，几种更年期大鼠模型表明，海马体、前额叶皮层和纹状体内单胺失调或减少可能与抑郁和认知能力下降有关，这在经历更年期的女性中可见。这些模型中单胺的失调已经使用HPLC-ECD进行了广泛的检查，尽管这些研究没有区分测量的神经递质含量与神经递质释放^5，6，7。单胺通过^{Ca2 +}依赖性囊泡释放⁹经典地释放到细胞外空间，并通过其各自的质膜再摄取系统（多巴胺转运蛋白，DAT;血清素转运蛋白，SERT;去甲肾上腺素转运蛋白，NET）^10，11循环。相反，数据表明，这些转运蛋白能够释放或排出单胺，因为已知苯丙胺（AMPH）和3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）等滥用药物分别通过其转运蛋白系统释放DA和5-HT12^{，13，14，15，16，17}.因此，对单胺释放动力学的正确机制理解对于开发特定和靶向的药物治疗至关重要。

已经采用了广泛的技术来研究单胺释放，例如快速扫描循环伏安法（FSCV）¹⁸，体内微透析¹³，成像¹⁹，放射性标记的单胺预孵育²⁰，光遗传学，以及最近的遗传编码荧光传感器和光度测定^法21，22.FSCV和体内微透析是用于研究单胺释放的主要技术。FSCV用于研究刺激的DA在急性脑切片和体内的胞吐释放²³。由于FSCV使用电极来刺激或唤起释放，因此神经递质释放的主要来源是^{Ca2 +}依赖性囊泡释放^{18，24，25，26，27，28，29，30，31}.体内微透析与HPLC相结合，使用放置在感兴趣大脑区域的探针测量细胞外神经递质水平的变化^13，32。与FSCV类似，体内微透析的一个主要限制是难以确定神经递质释放的来源:^{Ca2 +}依赖性囊泡释放或转运蛋白依赖性。值得注意的是，这两种方法都可以直接测量单胺释放。通过光遗传学的最新进展，研究表明，在短时间内检测到5-HT和DA释放，具有精致的细胞类型特异性^21，22。然而，这些策略需要复杂而昂贵的技术和设备，并间接测量单胺释放，特别是通过单胺与受体结合。此外，放射性标记的单胺也用于研究单胺动力学。放射性标记的单胺可以预加载到各种模型系统中，例如异源细胞过度表达每个单胺转运蛋白^{20，33，34，35，36，37，38，39，40}，原代神经元²⁰，突触体^{33，39，41，42}，和急性脑切片^43，44。然而，放射性对实验者造成潜在的伤害，并且氚标记的分析物可能无法忠实地概括内源性单胺动力学^45，46。超聚变系统与HPLC-ECD等离线检测方法相结合，允许从多个组织来源检测单胺。在这里，该协议提供了一种优化和低成本，简单和精确的方法，使用急性脑切片直接测量内源性基底和刺激的单胺释放。

急性脑切片允许测试机械假设，主要是因为它们保留了体内解剖学微环境，并保持完整的突触^47，48，^{49，50，51，52}。在一些研究中，急性脑切片或切碎的脑组织已与使用KCl刺激^{Ca2 +}介导的释放的超融合技术结合使用^{53，54，55，56}。超聚变系统对于推进该领域对神经递质释放机制（包括单胺）的理解至关重要。然而，这些系统相对昂贵，可用于组织分析的腔室数量从4-12不等。相比之下，这里介绍的方法价格低廉，可以测量48个组织样品，并且可以改进以使用多达96个组织样品。48孔板内的每个孔都包含组织支架，这些组织支架使用过滤器将释放的产物从组织中分离出来，然后通过HPLC-ECD收集和分析释放的单胺。重要的是，该方法允许在用调节单胺释放的药理剂治疗后，同时测量来自不同大脑区域（如前额叶皮层，海马体和背纹状体）的5-HT，DA和NE释放。因此，实验者可以使用廉价的多孔系统回答多个问题，该系统增加了测试样品的数量，从而减少了使用的动物数量。

研究方案

所有实验，包括动物处理和组织收集，都是根据佛罗里达大学和纽约城市学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）按照批准的协议201508873（UF）和1071（CCNY）进行的。有关试剂和缓冲液，请参阅 补充文件。

1. 准备急性大鼠脑切片

注意:在该实验中，使用成年雄性大鼠（250-350g）。然而，这种设置对于不同的发育点，雌性大鼠和其他物种是有效的。如果使用较小的动物，如小鼠，实验者可以通过在每个条件下使用不同数量的大脑切片或拳头来调整以优化方案。解剖缓冲液将被称为缓冲液1;外排缓冲液将称为缓冲液 2。

1. 准备补充 文件中提到的缓冲区 1。通过在冰上用95%/5%（_O2 / _CO2）冒泡20分钟，使缓冲液1充满氧气。取出 50 mL 缓冲液 1，在小烧杯或培养皿中冰镇冷却。该缓冲液用于保持急性收获的整个大脑。
2. 用1%-2%异氟醚麻醉一到两只成年大鼠（250-350克），用断头台将其斩首，然后迅速取出它们的大脑。立即将大脑置于步骤1.1中容器中的冰冷含氧缓冲液1中。
   注意:确保安全使用异氟醚和断头台。在通风橱下打开异氟醚。
3. 使用振动切片机或压缩切片机，从每个感兴趣的区域切割300μm日冕脑切片（图1）。在制作截面时，冒泡缓冲区 1 必须存在。使用不锈钢刮刀，小心并立即将脑切片转移到充满冰冷含氧缓冲液1的新培养皿中（图2）。
4. 通过使用大鼠脑图谱⁵⁷小心地将切片移动到载玻片（图1G）上，进一步解剖脑切片（例如，打孔，切出）。例如，根据其黑暗的条纹结构识别背纹状体，并根据其与皮层的接近程度和独特的螺旋结构来识别海马体。可以将左右半球分开用作对照和实验切片（图2G - H）。在这里，将背纹状体进一步解剖成2mm打孔（图1G）。
5. 使用截断尖端的塑料转移移液器，将切片或脑冲头转移到小容器中，浸入含氧冰冷的缓冲液1中，并冒氧。这些容器可以是不锈钢网，也可以是装有缓冲液的小培养皿（图1H）。

2. 从脑切片或冲孔中释放出体外内源性单胺

注:用于本节的设备由一个48孔板和一个由六个微量离心机过滤装置制成的组织支架组成，没有连接到碳原管路的插入过滤器（图2）。要制作支架，请使用坚固的塑料棒（例如，来自电池刮刀）并将微量离心机过滤装置超级胶水，而无需插入过滤器。让它干燥1-2天。内源性单胺释放实验所需的时间和苯丙胺、氟西汀和可卡因的浓度基于当前文献和先前的方案^13，20，58。

1. 组织活化
   1. 将脑组织从步骤1.1.5转移到流出室的每个孔中，并在37°C下在0.5-1mL含氧缓冲液2的玻片加热器上恢复30-50分钟，具有恒定，温和的气泡（图2B1）。
   2. 在此孵育过程中，将药物稀释至实验所需的浓度。所有药物必须溶解在缓冲液2中，浓度基于当前文献。
2. 首次孵化
   1. 将带有脑组织的组织支架移至含有500μL含氧缓冲液2的孔中，并在37°C下孵育20分钟。 通过敲击孔边缘的支架，确保将最少或没有缓冲液输送过来，直到支架中没有多余的缓冲液。
   2. 在使用单胺转运蛋白抑制剂等药理学药物的实验中，用在含氧缓冲液2中稀释的药物（例如，10μM氟西汀，40μM可卡因;见 图2B2）孵育组织样品。每个孔中的最终体积为500μL。
3. 第二次孵化
   1. 将带有组织的支架移动到一组含有500μL总缓冲液2的新孔中，无论是否具有每种药物的所需浓度。确保没有多余的缓冲区残留。对于实验条件，每个孔表示 n = 1。每个实验条件一式三份进行。
   2. 一个孔包括一个含氧缓冲液2，下一个10-30μM AMPH，最后一个孔包括10-30μM AMPH加单胺转运蛋白抑制剂。将每种药物溶解在含氧缓冲液2中。
   3. 在37°C下用500μL药物条件孵育组织20分钟。
      注意:额外的孔可能包括含氧高K +缓冲液2，带或不带单胺转运蛋白抑制剂。将每种药物溶解在含氧缓冲液2（500μL）中。
   4. 在20分钟的第二次孵育期间，从步骤2.2.1中第一次孵育的孔中收集溶液，并转移到含有50μL1 N高氯酸或磷酸（取决于HPLC的类型，终浓度0.1 N）的微量离心管中。样品的最终体积为550μL，将微量离心管保持在冰上，并标记管#1。
   5. 在第二次孵育20分钟后，将带有脑切片或冲孔的组织支架移动到空孔中，并将板保持在冰上。将上清液转移到含有50μL高氯酸或磷酸的微量离心管中。样品的最终体积为550μL，将微量离心管保持在冰上，并标记管#2。
   6. 向每个含有组织的孔中加入1 mL冰冷缓冲液1。使用小镊子收集所有组织，并转移到清洁的微量离心管中。
   7. 将脑组织管保持在-80°C。 弃去缓冲液1的1mL（图2B4）。
   8. 使用微量离心过滤器管（0.22μm）在2，500× g 下从每个孵育中获得的过滤溶液2分钟。使用滤液使用HPLC和电化学检测来确定单胺含量（图2B5）。

3. 组织活力

1. MTT 检测
   注意:关于这种实验设置的一个重大问题是组织活力，因为组织可以使用长达数小时⁵⁹。MTT测定^60，61 用于在实验结束时确定组织活力。该测定基于黄色四唑盐MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物）通过具有足够代谢的活细胞转化为紫色甲腈晶体。
   1. 实验后保持一组单独的组织样本，并将它们分成两组。
   2. 将一组在37°C下在溶解在缓冲液2中的Triton X-100（1%）中孵育20分钟作为对照。Triton X-100治疗导致细胞死亡。将第二组维持在缓冲液2中，并且不要在Triton X-100（组织活力对照）中孵育。
   3. 将MTT（储备溶液5mg / mL在PBS中，pH 7.4）加入含氧缓冲液2中的两组至终浓度为0.5mg / mL。
   4. 将组织样品在37°C下孵育20分钟，用PBS洗涤，然后转移到含有250μLS（10%，w / v），DMF（25%，v / v）和水的微量离心管中以溶解甲舐晶体。
   5. 将样品孵育24小时。
   6. 将试管以10，000×g离心10分钟，并使用酶标仪测量上清液（200μL）在562nm和690nm处的吸光度。组织活力计算如下:（_A562-A690）/组织重量。

4. 单胺的高效液相色谱分析

1. 使用HPLC-ECD根据先前的方案^13，44，使用反相柱定量每个实验条件下的单胺释放。
   1. 准备检测所需的流动相。这包括100 mM磷酸，100 mM柠檬酸，0.1 mM EDTA-Na2，600 mg / L辛烷磺酸，8%v / v乙腈（最终pH值6.0）。流动相的组成取决于所用HPLC的类型和色谱柱。
   2. 将电化学检测器（2 mm玻碳电极）的电位设置为0.46 V，并将流速设置为0.05 mL/min。
   3. 将5μL每个样品（包括神经递质标准品）加载到HPLC中，用于自动注射和检测。每个样品的添加量取决于所用HPLC的类型。
   4. HPLC完成运行后，使用给定的HPLC分析软件获取和分析色谱仪数据。
   5. 使用由每种单胺组成的标准曲线分析单胺含量（多巴胺:DA，去甲肾上腺素:NE和血清素:5-HT; 图 2C）。根据制造商的指南，使用生成的色谱图获得曲线下面积 （AUC）。

5. 制备用于蛋白质定量的组织裂解物

1. 蛋白质测定
   1. 将冰冷的裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂（0.1 g / 1 mL）加入每个含有脑切片/冲头的微量离心管中，并使用研杵均质器进行均质。微量离心管在均质时必须保持在冰上，以防止蛋白质降解。
   2. 在4°C下孵育组织匀浆1小时，轻轻旋转。
   3. 在4°C下以16，000× g 离心组织匀浆15分钟并回收上清液。
   4. 测定上清液中的蛋白质浓度，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品。
   5. 将每个脑样品中的单胺含量归一化为在250μL裂解的脑组织中测量的蛋白质总含量（μg）。使用下面的公式来确定nmol单胺/ g蛋白。df = 稀释因子。

6. 统计分析

1. 使用单因素方差分析单胺释放（nmol/g），然后进行Sidak的多重比较检验，以进行事后比较。
2. 使用独立组的不成对学生 t检验分析组织活力（对照组与1%Triton X-100）。
3. 对于所有统计分析，请将 alpha 水平设置为 ≤ 0.05。

结果

该技术描述了使用脑切片来测量内源性单胺的释放，使用HPLC和基于具有内部组织支架的48孔板的电化学检测。实验设置如图 1 和 图2所示。最初，为了确保在实验结束时的组织活力，进行了MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物，四氮唑）测定。经过功能实验后，与与1%Triton X-100（细胞死亡条件）孵育的急性脑切...

讨论

多年来，单胺释放测量已经在许多系统中进行，例如异源细胞，神经元培养物，脑突触体，离体急性脑切片和整个动物^13，20，^{41，42，58，64，65，66，67，}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 Well plate	NA	NA	Assay
Acetonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous	Sigma Aldrich	C1016	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software	Anetc
Citric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Dissection Buffer
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software	Graphpad Software, Inc		Statistical Analysis
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Lysis buffer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, LC-EC system
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid	Sigma Aldrich	A5960	Dissection Buffer
Magnesium Sulfate	Sigma	7487-88-9	KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree	Millipore	C7554	Assay - 6 to fit in 48 well plate
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Assay
Nanosep	VWR	29300-606	Assay; protein assay
Octanesulfonic acid	Sigma Aldrich	V800010	Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
Potassium Chloride	Sigma	12636	KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	1001655559	KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Dissection Buffer
Sodium Chloride	Sigma	S3014	KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma Aldrich	L3771	Lysis buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Assay / Lysis buffer