多西环素加载胶原蛋白-奇托桑复合支架，用于加速治疗糖尿病伤口

摘要

准备好的 DOX-CL 脚手架满足了机械强度、孔隙度、吸水率、降解率、持续释放、抗菌、生物相容性和抗炎特性的理想 DW 敷料的先决条件，这些都被认为是 DW 中受损组织恢复的关键。

摘要

糖尿病的一个主要并发症是糖尿病伤口（DW）。糖尿病炎症的延长阶段阻碍了导致伤口愈合延迟的进一步阶段。我们选择多西环素（DOX），作为一种潜在的药物的选择，因为它的抗菌性能，以及它报告的抗炎特性。目前的研究旨在制定DOX加载胶原蛋白-奇托桑非交联（NCL）和交联（CL）脚手架，并评估其在糖尿病条件下的愈合能力。脚手架的定性结果表明，与 DOX-NCL 脚手架相比，DOX-CL 脚手架具有理想的孔隙性、低肿胀和降解率以及 DOX 的持续释放。 体外 研究表明，与处理和控制组的 CL 脚手架相比，DOX-CL 脚手架具有生物相容性和增强的细胞生长。抗菌研究表明，DOX-CL脚手架比CL脚手架对DW中最常见的细菌更有效。使用链球菌素和高脂肪饮食诱导的DW模型，观察到DIX-CL脚手架治疗组的伤口收缩速度明显（p≤0.05）。使用 DOX-CL 脚手架可以证明是治疗 DW 的有希望的方法。

引言

糖尿病（DM）是一种身体未能提供胰岛素或对直接糖的异常消化结果作出反应的情况，导致血糖 ¹的激增。DM 最连续和最破碎的纠缠是糖尿病伤口 （DW）。大约25%的DM患者有机会在有生之年建立 ^DW。DW 的阻碍愈合被认可为 DM 的三种病变:免疫病变、血管病和神经病变。每当DW得不到治疗，它可能导致坏死的发展，因此促使有关器官 ²的删除。

大量的治疗方法，如指导病人（每天检查伤口，清洁伤口，避免对伤口造成压力的活动，定期葡萄糖监测等），控制他们的血糖，伤口脱脂，压力卸载，医疗程序，高压氧疗法，和先进的治疗是在实践^3，4。鉴于多因素病理生理条件和与这些药物相关的意外费用，这些药物大多未能解决DW护理至关重要的所有先决条件^。即使DW发病机制是多因素的，但组织管理不当的持续炎症是DW ^5、6中延迟愈合的实际原因。

DW中炎症和亲炎症调解人的增加水平导致导致伤口愈合延迟的生长因子减少^2，6。DW 中细胞外矩阵 （ECM） 的形成被认可为矩阵金属蛋白酶 （MMP） 水平增加，导致已形成的 ECM 的快速降解。在MMP中，MMP-9被报告为主要中间人，负责长期炎症和快速ECM降解^7。据说，局部治疗与抗炎药物，降低MMP-9的升高水平，重新建立皮肤平衡，框架安排，并提示更好的愈合DWs^8，9。

多西环素（DOX），一种MMP-9抑制剂，被选择来抑制MMP-9的升高水平，MMP-9是负责^10、11、12号DWs持续炎症的主要炎症调解人。此外，DOX 拥有抗氧化剂（产生能够与活性氧物种结合的自由羟基和苯氧基^）13和抗凋零（抑制卡斯帕塞表达和线粒体稳定^）14项对治疗 DW 至关重要的活动。选择了包含 DOX、胶原蛋白 （COL） 和奇托桑 （CS） 的框架安排。COL的选择取决于它如何帮助提供必要的框架负责机械强度和组织再生^15。另一方面，CS在结构上与糖糖糖素同源，与几个伤口愈合阶段相关。另据报道，CS持有显著的抗菌特性^15。因此，DOX 的 COL/CS 脚手架被配制以抑制长期炎症，然后支持矩阵形成，以便在 DM 条件下成功愈合伤口。

研究方案

所有动物程序都得到了印度奥蒂JSS药学院动物伦理委员会的批准。

1. 通过冷冻干燥方法制备 DOX 装载多孔脚手架

1. 将 1.2 克 COL 添加到 100 毫升水（例如米利波尔），并留出以防肿胀。
2. 在 2000 rpm 时搅拌肿胀的 COL 分散，以确保 COL 完全解散。
3. 通过溶解约 0.8 克 CS 在 100 mL 的 1% 醋酸中准备 CS 解决方案。
4. 在 2000 rpm 时将 CS 解决方案搅拌过夜，以确保均匀分散。
5. 将 DOX（1% w/v）混合，然后将 CS 解决方案混合到 COL 溶液中，搅拌 30 分钟。
6. 使用粘膜布过滤获得的物理混合物，以去除颗粒物。
7. 将获得的过滤剂在 -85 °C ± 4 °C 下深度冻结约 24 小时。
8. 将深冷冻混合物在 -85 °C ± 4 °C 72 h 下进行嗜好。
9. 将所得的脚手架存放在干燥器中，以便进一步分析^。

2. 脚手架的交叉链接

1. 在 50 mL 水中溶解 MES （0.488 g）。
2. 将 50 毫克的 DOX 装载脚手架浸泡在 MES 缓冲器的 20 mL 中，浸泡 30 分钟。
3. 将 19.5 mL 的 MES 缓冲器与 0.1264 克 EDC 和 0.014 克 NHS 混合在单独的烧嘴中。
4. 将脚手架浸入缓冲混合物中4小时，实现 ¹⁶的交联。
5. 存储 DOX 加载的交联 （CL） 和非交联脚手架 （NCL） 以进行进一步评估。

3. 脚手架的特征

1. 使用扫描电子显微镜（SEM）进行形态学检查
   1. 使用 SEM（1 厘米× 1 厘米× 0.5 厘米）对脚手架进行形态分析。
   2. 用细腻的黄金层（+150+）弄脏脚手架的横截面和外表面。
   3. 在 5 kV 和 10 kV 的激发电压下拍摄照片。
   4. 将样品放入铝存根中，并以大约 9 V 的黄金包裹。
   5. 使用 SEM 测量脚手架，分辨率提高 10 kV。
2. 孔隙度确定
   1. 使用液体位移法（乙醇 ^）18测量脚手架的孔隙度。
   2. 使用以下公式计算脚手架的孔隙度。
      
      W_w = 脚手架的湿重量
      W_d = 脚手架的干重量
      W_v = 脚手架的体积
3. 确定吸水能力
   1. 测量脚手架的干重。
   2. 在磷酸盐缓冲盐 （PBS） pH 7.4 中，在 37 °C 下孵育称重脚手架，换 24 小时。
   3. 使用滤纸去除脚手架上多余的 PBS。
   4. 使用以下公式 ¹⁷测量吸水能力。
      
      W_S = 吸水百分比
      W₁=脚手架的湿重量
      W₀= 脚手架的干重量
4. 脚手架降解
   1. 在 37 °C 下将脚手架（1 厘米 x 1 厘米）孵育 7 天，在含有酶的 pH 7.4 的 PBS 中。
   2. 清洗脚手架，去除表面上任何粘附的离子。
   3. 冷冻干燥洗过的脚手架^17。
   4. 使用公式计算降解率。
      
      Ww = 脚手架的初始重量
      Wd = 冻干后脚手架的重量
5. 体外 释放研究
   1. 使用透析袋法确定 DOX 从脚手架上的释放行为。
   2. 将脚手架分散在几毫升模拟伤口液（pH 7.4）中，并将其转移到透析袋中。
   3. 紧紧关闭膜袋的末端，沉浸在 500 mL 的模拟伤口液溶液中。
   4. 在 200-250 rpm 时搅拌含有透析袋的伤口液溶液。
   5. 收集超高溶液，并在一定时间间隔内用同等数量的新鲜缓冲液替换。
   6. 使用 240 nm 的紫外可见光谱仪确定超高频解决方案中脚手架中的 DOX 释放百分比。

4. 体外 抗菌研究

1. 使用微汤稀释法确定CL和DOX-CL脚手架对S.Aureus、S.表皮、大肠杆菌、P.Aeruginosa的最小抑制浓度（MIC）。
2. 使用穆勒-欣顿肉汤以1:1000的比例准备细菌培养物，以获得0.5麦克法兰浊度。
3. 添加D-葡萄糖（800毫克/分升）到细菌培养物高糖^19，20。
4. 在 DMSO 中对 CL 和 DOX-CL 进行薄荷和溶化（负控制）。
5. 连续稀释 96 井板中的高血脂细菌悬浮 （100 μL） 和测试样品（100 μL 脚手架溶液）。
6. 在 37 °C 下孵育板，20-24 小时。
7. 以600纳米 ²¹的波长记录吸收。

5. 体外 生物相容性研究

1. 使用 MTT [（3-（4，5 二甲基硫化物-2 yl） -2，5-二苯基三聚氰胺溴化物）评估制备脚手架的生物相容性。
2. 对标准尺寸的脚手架进行消毒，并将其放置在 24 个井板中。
3. 将 3T3-L1 细胞添加到 24 井板中，孵育 72 小时。

6. 体内 动物研究

1. 诱导 DM 和切除伤口
   1. 用高脂肪饮食喂养动物两周，并在柠檬酸盐缓冲液中给白化病大鼠（180-200克）服用一剂链球菌素（STZ）（50毫克/千克体重），用于诱导2型糖尿病。
   2. 选择血糖持续为250毫克/分升的动物进行研究。
   3. 随机选择的动物，以感应切除伤口。
   4. 使用二乙醚（5 mL 被添加到先前饱和麻醉室）麻醉糖尿病大鼠，并确认使用脚趾捏法和粘膜颜色。
   5. 使用无菌修剪器和刀片（A40）剃须肩部区域（多萨尔胸腔、腰部区域）。
   6. 用酒精棉签消毒剃须区。
   7. 在剃须区域使用无菌手术 A40 刀片切除皮肤（2 x 2 厘米² 和 1 mm 的深度），以创建一个开放的伤口。
   8. 将动物分成三组（第1组-疾病控制（控制），第2组-CL脚手架（安慰剂），第3组-DOX CL脚手架），每组由6只大鼠组成。
   9. 使用手术胶带贴上 CL 和 DOX CL 脚手架，用无菌纱布覆盖对照组 21 天。
   10. 在无菌 OHP 表上跟踪伤口区域，并使用网格方法测量所有组在 0、7、14 和 21 天伤口的减少百分比。
   11. 使用以下公式计算伤口减少百分比。
       

7. 组织病理学研究

1. 在第 7 天、第 14 天和第 21 天隔离愈合的伤口区域，储存在正式溶液中（10%）。
2. 使用微原子对组织进行分割，以获得 6 μm 的厚度。
3. 使用血氧林和欧辛 ¹⁷将部分安装在玻璃滑梯上并弄脏。
4. 使用数字显微镜捕捉 40 倍放大倍以下的图像。

8. 羟基丙线估计

1. 在第 0 天、第 7 天、第 14 天和第 21 天隔离愈合的伤口区域进行评估。
2. 使用 Reddy G 等人描述的程序估计羟基丙林含量，1996 ^{年 22 日}。

9. 伊丽莎测试

1. 根据制造商的说明，使用 Elisa 套件估计 MMP-9 级别。
2. 在第21天从愈合的伤口区域分离组织样本，然后使用组织同质化剂切碎。
3. 离心获得的同质化和收集超高纳特。
4. 使用检测缓冲器将超高纳特稀释 100 倍。
5. 使用多个板读取器扫描板。

10. 统计分析

1. 将获得的结果表示为平均± SD。
2. 使用图形垫棱镜 v5.01 执行统计分析。
3. 使用方差单向分析 （ANOVA） 和 Dunnet 的事后测试来获得统计学意义。
4. 将 p≤0.05 值视为重要值。

结果

DOX 加载 NCL 和 CL 脚手架的特征
在目视检查中，NCL 和 CL 脚手架被发现为彩色奶油色。此外，两个脚手架似乎都像海绵，僵硬和无弹性时，身体检查。NCL 和 CL 脚手架的 SEM 图像显示在 图 1中。从数字上看，通过形成分子间联系，在交叉链接后，孔径尺寸明显减少。此外，NCL和CL脚手架孔隙度分别为92.3±4.21和71.35±2.65。NCL和CL脚手架的吸水百分比为750±11.4%和492±8....

讨论

本研究的主要目的是确定 DOX 装载的 COL-CS 脚手架对大鼠 DW 愈合的影响。CL 和 NCL 在形态、肿胀指数、体外释放动力学和生物相容性方面进行了准备和评估。

DOX 加载 NCL 和 CL 脚手架的特征
已准备好的脚手架被发现多孔，毛孔相互连接。这些相互关联的毛孔确保多孔、海绵状的性质，有助于将氧气和营养物质适当扩散到细胞中，从而促进增殖和迁移，从而加速愈...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Merck Millipore, Mumbai, India	E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)	Merck Millipore, Mumbai, India	137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)	Thermo Fisher, Mumbai, India	M6494
Deep freezer verticle	Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack	Merck Millipore, Mumbai, India	D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	D9891
Elisa kit	R&D Systems	RMP900
Escherichia coli (E. coli)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2567
Ethanol	Merck Millipore, Mumbai, India	100983
Lyophilizer-SZ042	Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D	Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	18824
Microtome-RM2135	Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)	National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro	Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800	Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets	Qualigen fine chemicals, Mumbai, India	Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5270
Streptozotocin (STZ)	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	14653
Type-1 rat Collagen	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700	Shimadzu