原发性小鼠视网膜色素上皮细胞的有效解剖与培养

摘要

该协议最初由费尔南德斯-戈迪诺等人于2016年1月报告，描述了一种有效分离和培养小鼠RPE细胞的方法，该细胞在一周内在Transwell板上形成功能和极化的RPE单层。手术大约需要3个小时。

摘要

眼疾影响全球数百万人，但人体组织的有限可用性阻碍了他们的研究。小鼠模型是了解眼科疾病病理生理学的有力工具，因为它们与人体解剖学和生理学相似。视网膜色素上皮（RPE）的改变，包括形态和功能的变化，是许多眼部疾病共有的共同特征。然而，成功隔离和培养原鼠RPE细胞是非常具有挑战性的。本文是费尔南德斯-戈迪诺等人之前在 2016 年发布的协议的更新视听版本，旨在有效隔离和培养主要鼠标 RPE 细胞。这种方法具有高度可重复性，并导致高度极化和色素化的 RPE 单层的坚固培养物，可在 Transwells 上保持数周。该模型为研究眼部疾病背后的分子和细胞机制开辟了新的途径。此外，它提供了一个平台，用于测试治疗方法，可用于治疗重要的眼部疾病与未满足的医疗需求，包括遗传性视网膜疾病和黄斑变性。

引言

该协议最初由费尔南德斯-戈迪诺等人于2016^年1月报告，描述了一种有效隔离和培养小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，该细胞在一周内在Transwell板块上形成功能性和极性RPE单层。RPE 是位于神经视网膜和布鲁赫膜之间的眼睛中的单层。这一层由高度极化和色素化的上皮细胞组成，由紧密的结点连接，呈现出类似于蜂巢²的六边形形状。尽管这种明显的组织学简单，RPE执行各种功能的关键视网膜和正常的视觉周期^2，3，4。RPE单层的主要功能包括光吸收、光感受器的滋养和更新、代谢端产品的去除、亚视网膜空间中的离子平衡控制以及血视网膜屏障^2、3的维护。RPE在眼睛^{5、6、7、8、9、10、11}的局部调节中也起着重要的作用。RPE的退化和/或功能障碍是许多眼部疾病的共同特征，如视网膜炎色素沉着症，勒伯先天性动脉瘤，白化病，糖尿病视网膜病变，和黄斑变性12，13，14，15。不幸的是，人体组织的可用性是有限的。鉴于小鼠与人类高度保存的遗传同源性，小鼠模型是研究眼部疾病^{16、17、18、19}的合适和有用的工具。此外，使用培养的原发性RPE细胞提供的优势，如基因操纵和药物测试，可以加快开发新的疗法，这些危及视力的疾病^9，11。

可用于鼠标 RPE 隔离和文化的现有方法缺乏可重复性，并且无法以足够的可靠性在体内重新概括 RPE 功能。细胞往往在几天内失去色素化，六角形和跨皮电阻（TER）在培养^13，20。由于从小鼠身上建立这些初级RPE细胞培养是一个具有挑战性的过程，这个优化的协议已经创建基于其他协议，从大鼠和人眼分离RPE细胞21，22，23解剖小鼠的眼睛，收集RPE和培养小鼠RPE细胞在体外。

研究方案

遵循了《在眼科和视力研究中使用动物的ARVO声明》的准则。

注:这种方法已被证明对不同遗传背景的小鼠成功，包括C57BL/6J，B10。D2-Hc^o H2^d H2-T18 c/oSnJ和白化病小鼠，在不同年龄。最好使用8到12周大的小鼠来获得RPE细胞。来自老老鼠的RPE细胞在培养中繁殖较少，而幼鼠的细胞越来越小，这就要求汇集不同动物的眼睛才能有可行的培养物。

1. 准备试剂和膜插入

1. 准备以下试剂。
   1. 准备 HBSS-H−（无钙的 HBSS，无镁缓冲器 + 10 mM HEPES）:将 1 mL 的 1 M HEPES 添加到 99 mL HBSS - （无 Ca/Mg） 缓冲区。存储在4°C至1个月。
   2. 准备 HBSS-H+ （含钙的 HBSS，含镁缓冲器 + 10 mM HEPES）:将 1 mL 的 1 M HEPES 添加到 99 mL HBSS® （含 Ca/Mg） 缓冲区。存储在4°C至1个月。
   3. 准备透明质溶液（1毫克/mL）:将10毫克透明质酶添加到10毫升的HBSS-H−并使用10mL注射器使用0.4微米无菌注射器过滤器进行过滤。使用前准备新鲜，并在室温下离开（RT:20-25°C）。
   4. 准备 FBS 解决方案:将 20% 的 FBS 与 HBS-H+ 混合。将 2 毫升 FBS 添加到 8 毫升的 HBS-H+ 中。使用前准备新鲜。
   5. 准备 RPE 介质: N1 中等补充 1/100 （v/v）， 谷氨酰胺 1/100 （v/v）， 青霉素链霉素 1/100 （v/v） 和非必要氨基酸溶液 1/100 （v/v） ），氢皮质松 （20μg/L）， 陶林 （250 毫克/升） 和三叶草 - 胸腺素 （0.013 微克/升） 在阿尔法 MEM + 5% FBS 或没有 FBS^1，23，24.如果需要，FBS 可能会被热灭活:没有观察到任何差异。为 RPE 隔离准备新鲜。对于细胞培养维护，存储在4°C长达1个月。
   6. 准备特普辛-EDTA:准备新鲜的三丁基-EDTA（0.25%） 的小一次性别名（+8 mL）并将它们冻结在-20°C。每次使用前在RT解冻它们。避免冻结-解冻周期。
2. 准备膜插入（例如，跨井插入）。
   1. 在 37 °C 时，在 5% 的 CO 2 -aerated 孵化器中，用 RPE 介质平衡_6.5mm 膜插入至少 30 分钟。使用一个膜插入从两个鼠标的眼睛种子RPE细胞。
   2. 孵化后，用 700 μL 的 PBS 替换下舱的介质。
   3. 从顶部隔间取出介质，在 RT 处涂上 100μL 的 100μl 10 μg/mL 鼠标层蛋白（在 PBS 中），至少 2 小时（较短的孵化可能导致细胞对插入物的附着不良）。
   4. 涂上额外的膜插入，用作 TER 测量的空白。

2. 解剖和引诱鼠标眼睛

1. 通过_将小鼠_{放入二氧化碳}室，并以每分钟30-70%的填充率缓慢释放二氧化碳，通过二氧化碳窒息使小鼠安乐死。
2. 将微力的倾斜、锯齿状尖端放在鼠标眼睛的每一侧，轻轻按压以支撑眼球（诱导）。
3. 关闭放置在眼球周围的钳子。然后，向前和向后移动时轻轻拉动，用视神经将整个眼睛与眼部肌肉分离，确保没有结缔组织仍然附着在硬皮上。
4. 在70%乙醇中冲洗被诱导的眼球，然后将其放入一个六井板的一口井中，在冰上放置3mL的HBSS-H−。
5. 重复步骤 2.2 到 2.4 以移除鼠标的第二只眼睛。在 30 分钟内继续执行后续步骤。
   注:建议一次只切除两只眼睛，直到获得一些经验。

3. RPE 的集合

注意:在层压流罩的无菌条件下执行以下步骤。为了避免在冰上延长潜伏期，这可能导致 RPE 细胞死亡，一次收集不超过两只眼睛。

1. 使用解剖立体显微镜，杜蒙#5钳子和斜剪刀小心地清理所有粘附在眼球上的结缔组织、血液和肌肉，而不会在囊中有任何切口。根据需要定期更换 3 mL 的 HBSS-H −缓冲器，以保持眼睛新鲜和清洁，并避免 RPE 培养物的污染。
2. 使用视神经作为手柄，用锋利的碳钢#11刀片在角膜中心打一个洞。
3. 使用杜蒙#5剪刀通过上述孔在角膜上切开三个切口，确保有足够的空间去除镜片。
4. 抓住视神经，用斜剪刀的底座对奥拉塞拉塔施加轻微的压力，直到镜头完全出来。将虹膜上皮留在原位，以防止潜伏期间神经网膜和 RPE 的分离。将眼睛放在 HBSS-H 缓冲器中。
5. 重复步骤 3.1-3.4 解剖第二只眼睛。
6. 在 37 °C 的 12 井板中孵化无镜片的眼睛，在 5% CO₂- 通风孵化器（1.5 mL/井）中 45 分钟，将神经视网膜从 RPE 中分离出来。
7. 将每只眼睛放在一口新井中，在冰上孵育30分钟，每口油井1.5mL的冷HBSS-H+缓冲器，以阻止透明质酶活动。不要将孵化时间延长超过 45 分钟。
8. 洗净，并用新鲜的 HBSS-H+ 缓冲器将每只眼睛放入 35 毫米培养皿中，然后用 8 厘米的 Vannas 剪刀切开角膜，直到到达奥拉塞拉塔。然后，切下奥拉塞拉塔，以去除虹膜上皮和角膜。
9. 用弯曲的钳子保持眼杯边缘/奥拉塞拉塔，并使用倾斜的微力拉开神经视网膜，确保 RPE 层不被切割。然后，切断视神经的内部附件。如果一些 RPE 细胞仍然附着在神经网膜上，请延长潜伏时间，但总时间不超过 45 分钟。
10. 切开视神经，将每个眼杯转移到不同的12井板，每口井含有1.5毫升的新鲜三氯辛-EDTA。确保眼杯保持打开，并完全淹没在肌氨脂中。在 5% 的 CO₂ 孵化器中，在 37 °C 孵化眼杯 45 分钟。
11. 将每个眼杯与在尝试普辛孵化过程中分离的任何 RPE 表一起收集，并将其转移到包含每口油井 1.5 mL FBS 解决方案的 12 井板中。如果 RPE 表仍保留在试穿素溶液中，请使用微管将它们转移到带 FBS 解决方案的井中。

4. 隔离原鼠RPE细胞

1. 将每个眼杯由视神经按住，朝下摇动到 12 井板中，其中含有 HBSS-H+ 中 20% FBS 的 1.5 mL，直到 RPE 表完全分离。
2. 用微管收集任何 RPE 表和 RPE 集群，并将其放置在 15 mL 管中。避免任何白色的鳞片或巧克力，这可能会污染文化。将同一只鼠标的两只眼睛池在一个管子里。
3. 在 RT 以 340 x g 的速度将混合物离心 2 分钟，然后丢弃超自然。
4. 在 1 mL 的尝试素 - EDTA 中轻轻恢复 RPE 颗粒 （0.25%）并在37°C的水浴中孵育混合物1分钟，将RPE表分解成单个细胞。孵化后，用微管轻轻上下吹10次，避免在管道时形成气泡。
5. 加入 9 mL 的新鲜制备 RPE 介质，以稀释和灭活 trypsin，并在 RT 以 340 x g 将混合物离心机加热 2 分钟。
6. 吸气超自然，并小心地用5%FBS在150μL的RPE介质中补充细胞颗粒，确保细胞在管道管道中均匀地恢复并避免气泡形成。
7. 从步骤 1.2 中插入层蛋白涂层膜，从底部腔室中去除 PBS，并添加 700 μL 的 RPE 介质。
8. 从膜插入的上腔取出层蛋白，并顺流而均匀地将 RPE 细胞悬架分配到腔室的中心，避免在管道时形成气泡。
9. 将膜插入 5% CO₂ 孵化器中，在 37 °C 时保持不受干扰，至少 24 小时。
10. 24小时后，检查显微镜下的膜插入，以确保大多数 RPE 细胞连接到插入物上，汇合率至少为 50%（图 1A）。在前 72 小时内不更换媒体至关重要。

5. 极化 RPE 单层文化

1. 在刷新 RPE 介质以允许细胞连接之前，在培养中保持隔离的 RPE 细胞至少 72 小时。在播种时，50%或以上的细胞汇合对于形成合适的极化 RPE 单层至关重要。
2. 连接细胞后，每周使用新鲜和预热 RPE 介质（步骤 1.1.5）更改培养介质两次。血清可以在前 72 小时后从培养介质中去除。
   注意:在培养一周后，细胞应是结合的，六角形的，双核的，色素和极化的（图1B），预计细胞数量约为50，000细胞每6.5毫米Transwell插入。在培养两周后，观察由健康细胞组成的RPE单层。RPE 文化显示 apical 微维利、基底折叠和紧密的交汇点 （图 1C）。

6. TER 测量

注:在培养后至少4天对RPE细胞进行TER测量，以确保RPE单层细胞的完整性和极化。

1. 用70%的乙醇清洁伏特米电极，并小心干燥。
2. 从孵化器取出转井，并在 3 分钟内进行 TER 测量，以避免因温度波动而发生改变。要测量 TER，请将伏托赫米短电极浸入上腔和膜插入的底部腔中。避免与 RPE 单层接触，以防止细胞分离。
3. 要计算 TER，请从样品中扣除空白值（在没有细胞的情况下涂有层蛋白的膜插入）。然后乘以膜插入的表面积（0.33 厘米² 在 6.5 毫米膜插入的情况下）获得的价值（在 Ohms 中）。该产品应至少200 Ω×厘米² 后72小时的文化。两周后，TER 值应测量在 400 Ω x cm² 以上。丢弃具有低TER值的RP文化。

结果

该协议已被用来隔离和培养RPE细胞从转基因小鼠^1。没有观察到小鼠菌株或性别之间的差异。研究结果有助于了解眼部疾病机制的一些重要方面，如与年龄有关的黄斑变性，这是老年人视力丧失的最常见原因^。在此协议后分离的 RPE 细胞在播种后 24 小时内完全连接到膜插入上，并在 72 h¹后显示典型的 RPE 大小、形态和色素沉着。一周后，一个高?...

讨论

虽然在^{1、13、20、22、26、27}之前已经开发出几种小鼠RPE细胞分离和培养方法，但费尔南德斯-戈迪诺的方法首先使用膜插入，使RPE细胞在培养中的有效生长长达1周^，即9周。他们的协议^1，9...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504