从特纳综合征（45XO）胎儿细胞生成诱导多能干细胞，用于与该综合征相关的神经功能障碍的下游建模

摘要

该协议描述了通过核切除递递递外体质粒，然后描述用于iPSC表征和神经元分化的方法，从胎儿组织成纤维细胞中产生整合的游离iPSCs。

摘要

染色体非整倍体可引起严重的先天性畸形，包括中枢神经系统畸形和胎儿死亡。产前遗传学筛查纯粹是诊断性的，并不能阐明疾病机制。虽然来自非整倍体胎儿的细胞是带有染色体非整倍性的宝贵生物材料，但这些细胞的寿命很短，限制了它们在下游研究实验中的应用。诱导多能干细胞（iPSC）模型的生成是细胞制备非整倍体性状永久保存的有效方法。它们是自我更新的，并分化成特化细胞，让人联想到胚胎发育。因此，iPSC是研究早期发育事件的极好工具。特纳综合征（TS）是一种与完全或部分缺失的X染色体相关的罕见疾病。该综合征的特征是不孕症，身材矮小，内分泌，代谢，自身免疫和心血管疾病以及神经认知缺陷。以下方案描述了从TS（45XO）胎儿组织中分离和培养成纤维细胞，通过细胞核切除递送表观体重编程质粒，然后进行表征，从而产生整合游离的TsiPSCs。重新编程的TSIPSCs最初通过活细胞碱性磷酸酶染色进行筛选，然后对多能性生物标志物进行广泛的探测。对选定的菌落进行机械解剖，传代几次，并使用稳定的自我更新细胞进行进一步的实验。细胞表达多能转录因子OCT4、NANOG、SOX2、细胞表面标志物SSEA 4和TRA1-81是典型的多能干细胞。最初的45XO核型在重新编程后保留。TSiPSCs能够形成胚状体并分化成内胚层，中胚层和表达外胚层的细胞谱系特异性生物标志物（（SRY BOX17），（肌球蛋白室重性CHAINα / β），（βIII管蛋白））。外源性外生体质粒自发丢失，在细胞中第15代后未检测到。这些TSiPSCs是一种宝贵的细胞资源，用于模拟导致与特纳综合征相关的神经认知缺陷的有缺陷的分子和细胞神经发育。

引言

非整倍体导致人类出生缺陷/先天性畸形和妊娠丢失。~50%-70%的妊娠丢失标本显示细胞遗传学异常。在怀孕早期丢失的非整倍体胚胎不容易获得用于实验分析，因此需要开发其他密切代表人类胚胎发生的模型。来自被诊断患有遗传疾病的细胞的诱导多能干细胞（iPSCs）已被用于模拟代表性的遗传不规则性及其对胎儿发育的影响^{1，2，3，4。}这些iPSC类似于发育中胚胎的外胚层细胞，可以概括胚胎形成的早期事件。它们允许理解和表征早期哺乳动物胚胎中细胞谱系和模式的发育程序。iPSCs以前来自皮肤成纤维细胞和羊膜细胞，来自非整倍性综合征的产前诊断测试，如单体X（特纳综合征），8三体性（Warkany综合征2），13三体性（Patau综合征）和部分三体11;22（伊曼纽尔综合征）提供了有关失败发展的宝贵见解⁴。

特纳综合征（TS）是一种罕见的疾病，其特征是女性不育，身材矮小，内分泌和代谢紊乱，自身免疫性疾病风险增加以及心血管疾病易感性⁵。虽然它是唯一可存活的单体综合征，但它对导致自然流产的发育中的胚胎也是致命的⁶

研究方案

FCV是在马尼帕尔医院伦理委员会的批准下从班加罗尔的马尼帕尔医院获得的。

注：所有缓冲液和溶液的组成见表1。

1. 从胎儿绒毛膜绒毛（FCV）中分离成纤维细胞

1. 胶原酶中的样本采集和组织分解
   1. 在无菌条件下在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中收集FCV，并将（室温下）转运到细胞培养设施。
   2. 将绒毛转移到60毫米培养皿中，并在含有1x抗生素抗真菌剂溶液（PBS-AA）的PBS中洗涤几次（至少4次）。通过移液完全去除PBS-AA。
   3. 用1 mL胶原酶混合物（5mg / mL）在37°C下处理绒毛膜绒毛5分钟。
   4. 用含有10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基中和，将消化物转移到15mL管中，并以225×g离心5分钟以收集分解的绒毛和释放的细胞作为沉淀。
2. 亚文化和种群扩张
   1. 将绒毛与释放的细胞一起在含有5mL完整培养基（例如AmnioMAX）的T25培养瓶中分解，并生长直至获得汇合成纤维细胞培养物。
   2. 扩增培养物中的成纤维细胞，以制备储液，用于随后的转染和表征实验，如下所示：
      1. 将2mL0.05%胰蛋白酶加入含....

结果

从具有45XO核型的自发流产胎儿中生成无整合的iPSC
我们从具有特纳综合征（TS）特异性45XO核型的FCV中分离出成纤维细胞，并用外显体重编程质粒对其进行核感染，以产生可用于综合征下游建模的TSIpSC，特别是相关的神经功能缺陷（图1a&b）。我们使用非整合的表观载体和核检点进行转染实验（图1 c&d）。我们跟踪?.......

讨论

生成细胞遗传学异常胎儿组织的稳定细胞模型对于使有缺陷的表型永久化是必要的。iPSC途径是永久保存缺陷特性的最有效的细胞制备方法^20。

多能干细胞（PSC）显示出自我更新和分化成特化细胞的特性，让人联想到早期裂解胚胎^21。因此，PSC可以作为研究过早流产胎儿的早期分子，细胞和发育缺陷的优秀模型。

在本文?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	-	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays