从特纳综合征（45XO）胎儿细胞生成诱导多能干细胞，用于与该综合征相关的神经功能障碍的下游建模

摘要

该协议描述了通过核切除递递递外体质粒，然后描述用于iPSC表征和神经元分化的方法，从胎儿组织成纤维细胞中产生整合的游离iPSCs。

摘要

染色体非整倍体可引起严重的先天性畸形，包括中枢神经系统畸形和胎儿死亡。产前遗传学筛查纯粹是诊断性的，并不能阐明疾病机制。虽然来自非整倍体胎儿的细胞是带有染色体非整倍性的宝贵生物材料，但这些细胞的寿命很短，限制了它们在下游研究实验中的应用。诱导多能干细胞（iPSC）模型的生成是细胞制备非整倍体性状永久保存的有效方法。它们是自我更新的，并分化成特化细胞，让人联想到胚胎发育。因此，iPSC是研究早期发育事件的极好工具。特纳综合征（TS）是一种与完全或部分缺失的X染色体相关的罕见疾病。该综合征的特征是不孕症，身材矮小，内分泌，代谢，自身免疫和心血管疾病以及神经认知缺陷。以下方案描述了从TS（45XO）胎儿组织中分离和培养成纤维细胞，通过细胞核切除递送表观体重编程质粒，然后进行表征，从而产生整合游离的TsiPSCs。重新编程的TSIPSCs最初通过活细胞碱性磷酸酶染色进行筛选，然后对多能性生物标志物进行广泛的探测。对选定的菌落进行机械解剖，传代几次，并使用稳定的自我更新细胞进行进一步的实验。细胞表达多能转录因子OCT4、NANOG、SOX2、细胞表面标志物SSEA 4和TRA1-81是典型的多能干细胞。最初的45XO核型在重新编程后保留。TSiPSCs能够形成胚状体并分化成内胚层，中胚层和表达外胚层的细胞谱系特异性生物标志物（（SRY BOX17），（肌球蛋白室重性CHAINα / β），（βIII管蛋白））。外源性外生体质粒自发丢失，在细胞中第15代后未检测到。这些TSiPSCs是一种宝贵的细胞资源，用于模拟导致与特纳综合征相关的神经认知缺陷的有缺陷的分子和细胞神经发育。

引言

非整倍体导致人类出生缺陷/先天性畸形和妊娠丢失。~50%-70%的妊娠丢失标本显示细胞遗传学异常。在怀孕早期丢失的非整倍体胚胎不容易获得用于实验分析，因此需要开发其他密切代表人类胚胎发生的模型。来自被诊断患有遗传疾病的细胞的诱导多能干细胞（iPSCs）已被用于模拟代表性的遗传不规则性及其对胎儿发育的影响^{1，2，3，4。}这些iPSC类似于发育中胚胎的外胚层细胞，可以概括胚胎形成的早期事件。它们允许理解和表征早期哺乳动物胚胎中细胞谱系和模式的发育程序。iPSCs以前来自皮肤成纤维细胞和羊膜细胞，来自非整倍性综合征的产前诊断测试，如单体X（特纳综合征），8三体性（Warkany综合征2），13三体性（Patau综合征）和部分三体11;22（伊曼纽尔综合征）提供了有关失败发展的宝贵见解⁴。

特纳综合征（TS）是一种罕见的疾病，其特征是女性不育，身材矮小，内分泌和代谢紊乱，自身免疫性疾病风险增加以及心血管疾病易感性⁵。虽然它是唯一可存活的单体综合征，但它对导致自然流产的发育中的胚胎也是致命的⁶。TS的存活个体表现出细胞中X染色体物质的改变程度。核型的范围从完全失去一条X染色体（45，XO）到像45，XO / 46，XX这样的马赛克;45，XO / 47，XXX，环形染色体的存在，Y染色体物质的存在等^5。

该综合征的诊断通常通过对有症状个体的血液进行核型分析，并进行绒毛膜绒毛取样 （CVS） 以检测早期非整倍性综合征。由于非整倍性综合征约占自然流产的30%，因此在自然流产时对受孕产物（POC）进行核型分析是常规的。这些胎儿细胞包括具有细胞遗传学异常的绒毛膜绒毛和衍生自它们的iPSCs，为研究非整倍性综合征^4，6提供了宝贵的生物材料来源。TS iPSCs先前已通过逆转录病毒重编程⁴从羊膜细胞，通过逆转录病毒重编程⁶从羊膜细胞，通过逆转录病毒重编程6从绒毛膜绒毛的成纤维细胞（通过产前诊断获得）建立，通过仙台病毒重编程从血液单核细胞⁷通过慢病毒重编程从TS个体的皮肤成纤维细胞^4建立。.由于我们实验室的主要重点是了解发育障碍，因此我们从POC中产生了TS iPSCs，特别是自然流产的绒毛膜绒毛成分⁸。从该胎儿组织中分离出的所有细胞均具有45XO核型，并产生具有相同核型的iPSCs。这些iPSC是独一无二的，因为它们是第一个从流产胎儿产生的，并为研究非整倍性相关的妊娠失败提供了宝贵的资源。本文提供了通过外显体重编程从这种独特的细胞源产生iPSCs的详细方法。

iPSC生成的早期方法使用病毒转导和转座子来传递重编程因子。诱导细胞多能性的方法已经从使用整合逆转录病毒载体^9、可切除慢病毒载体^10、11和基于转座子的方法¹²发展到非整合性腺病毒载体¹³和仙台病毒载体^14。基于逆转录病毒和慢病毒的重编程虽然有效，但涉及将重编程因子整合到宿主染色体中，导致插入突变，从而在iPSC中产生不可预见的影响。此外，基于病毒的重编程可防止 iPSC 的转化应用。已经探索了基于RNA的系统¹⁵和直接蛋白递送^16，以完全消除与使用病毒和DNA转染相关的潜在风险。然而，这些方法已被证明是低效的。

2011年，Okita等人报道了通过shRNA增强TP53抑制的外生质粒来提高重编程效率。他们还用非转化性LMYC（与MYC相关的小细胞肺癌）代替了cMYC，以提高hiPSC的安全性。这些外生体质粒表达5种重编程因子:OCT4，LIN28，SOX2，KLF4，LMYC和shRNA用于TP53^17，18。这些载体在染色体外保持，并在连续培养时从重编程的细胞中丢失，从而使品系在10-15次传代内无转基因。核细胞分离是一种特殊形式的电穿孔，可将核酸直接输送到宿主细胞的细胞核中。它是将重编程质粒递送到各种细胞类型的有效方法。外显体质粒具有成本效益，并补偿了细胞核摘除的高成本。该方法在优化条件下高效且可重复，可从各种体细胞中产生稳定的iPSC。在该协议中，我们描述了通过对外显体重编程质粒进行核切除术，从胎儿组织中分离的成纤维细胞产生iPSCs的方法。以下是从胎儿绒毛膜绒毛中分离成纤维细胞，质粒纯化，核切除，从重编程板中挑选集落以及建立稳定的iPSCs的详细方案。

必须确认新生成的iPSC中存在多能性状。这包括多能性相关因素的证明（例如，碱性磷酸酶表达，NANOG，SSEA4，Tra 1-80，Tra 1-81，E-钙粘蛋白;通常用免疫荧光或基因表达测定显示），通过体外分化测定鉴定三个胚层以验证其分化潜力，核型分析以确定染色体含量，STR分型以建立与亲本细胞的身份，验证外源性基因的丢失， 以及更严格的体内检测，如畸胎瘤形成和四倍体互补。在这里，我们描述了核型分析的表征方案，活细胞碱性磷酸酶染色，通过免疫荧光检测多能性相关生物标志物，体外分化测定和证明外源基因丢失的方法^19。

研究方案

FCV是在马尼帕尔医院伦理委员会的批准下从班加罗尔的马尼帕尔医院获得的。

注:所有缓冲液和溶液的组成见表1。

1. 从胎儿绒毛膜绒毛（FCV）中分离成纤维细胞

1. 胶原酶中的样本采集和组织分解
   1. 在无菌条件下在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中收集FCV，并将（室温下）转运到细胞培养设施。
   2. 将绒毛转移到60毫米培养皿中，并在含有1x抗生素抗真菌剂溶液（PBS-AA）的PBS中洗涤几次（至少4次）。通过移液完全去除PBS-AA。
   3. 用1 mL胶原酶混合物（5mg / mL）在37°C下处理绒毛膜绒毛5分钟。
   4. 用含有10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基中和，将消化物转移到15mL管中，并以225×g离心5分钟以收集分解的绒毛和释放的细胞作为沉淀。
2. 亚文化和种群扩张
   1. 将绒毛与释放的细胞一起在含有5mL完整培养基（例如AmnioMAX）的T25培养瓶中分解，并生长直至获得汇合成纤维细胞培养物。
   2. 扩增培养物中的成纤维细胞，以制备储液，用于随后的转染和表征实验，如下所示:
      1. 将2mL0.05%胰蛋白酶加入含有FCV成纤维细胞的T25烧瓶中，并在37°C下孵育3-5分钟以解离细胞。
      2. 孵育后，通过添加FBS（与胰蛋白酶相同体积）中和胰蛋白酶。
         注意:当以1:3的胰蛋白酶:培养基比例加入时，含有FBS的培养基也可用于中和胰蛋白酶。
      3. 将解离的细胞收集在15mL管中，并以225×g离心5分钟以获得细胞沉淀。
      4. 倾析上清液并将细胞沉淀重悬于1mL完整培养基中。
      5. 将500μL每个转移到60mm组织培养皿中，并将体积组成5mL。这种1:2的分裂比例也用于后续的段落。
3. 冷冻保存
   1. 按照步骤1.2.2.1 - 1.2.2.3中所述，使用0.05%胰蛋白酶进行酶解解离并获得细胞沉淀。
   2. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL冷冻混合物中，该混合物包含1:9二甲基亚砜（DMSO）:FBS。
   3. 将内容物转移到无菌冷冻管中，并将小瓶置于冷冻容器中。
   4. 在-80°C下冷冻过夜，然后第二天将小瓶转移到液氮（-196°C）中。

2. 质粒DNA分离和验证

1. 细菌细胞制备
   1. 在单独的Luria Bertani-氨苄青霉素琼脂平板上含有三种单一质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，pCXLE-hSK和pCXLE-hUL（来自Addgene） 的大肠 杆菌条纹甘油储备。
   2. 将单个菌落接种到5 mL Luria Bertani-氨苄西林培养基的发酵培养物中。在37°C下摇动（10×g）孵育8小时。
   3. 将200μL该起始培养物接种到100mL Luria Bertani-氨苄西林培养基中。在37°C振荡孵育过夜。
   4. 通过在4°C下以6000×g离心15分钟收获过夜细菌培养物。
2. 使用Midi质粒纯化试剂盒进行质粒分离
   1. 将细菌沉淀重悬于4 mL重悬缓冲液中。
   2. 加入4mL裂解缓冲液，通过剧烈倒置4-6次彻底混合，并在室温下孵育5分钟。
   3. 加入4 mL预冷中和缓冲液，倒置管4-6次，充分混合。在冰上孵育15分钟。
   4. 在4°C下以≥20，000×g离心30分钟。 在新鲜管中收集上清液，并在4°C下以≥20，000×g重新离心15分钟。
   5. 通过施用4mL平衡缓冲液来平衡色谱柱。
   6. 将上清液涂在色谱柱上。
   7. 用10 mL洗涤缓冲液洗涤柱两次。
   8. 用5 mL温（65°C）洗脱缓冲液洗脱DNA。
   9. 通过将3.5mL异丙醇加入洗脱的DNA来沉淀DNA。混合均匀。在4°C下以≥15，000×g离心30分钟。 小心倾析上清液。
   10. 用2mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，并以≥15，000×g离心10分钟。小心倾析上清液。
   11. 风干沉淀5-10分钟，并将DNA溶解在合适体积的PCR级水中，以获得1μg/ mL的最终浓度。
       注意:不要将DNA溶解在缓冲液中，因为它不适合电穿孔。旧的质粒DNA制备不会产生重编程的菌落。
3. 通过 EcoRI 限制性酶切进行质粒验证
   1. 混合15μL无核酸酶水，2μL10x缓冲液，1μg质粒DNA和1μL EcoRI酶。轻轻混合。
   2. 将混合物在37°C下在热块中孵育15分钟。
   3. 将消化的质粒样品与6x DNA凝胶上样染料混合，并在1%琼脂糖凝胶上电泳，在1x TAE缓冲液中加入0.5μg/ mL溴化乙锭。包括标准 DNA 分子量标准品。在DNA适当解析后对凝胶进行成像。pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F的预期EcoRI条带尺寸为6，834 bp，3，758 bp和1，108 bp;pCXLE-hUL为10，200 bp和1，900 bp;pCXLE-hSK为10，200 bp和2，500 bp。

3. 细胞核切除术

1. 细胞造粒
   1. 将分离的胎儿绒毛膜绒毛膜成纤维细胞放入 T25 培养瓶中，以 5 mL 完全培养基培养至 80-90% 汇合度。
   2. 用PBS洗涤细胞两次，并按照步骤1.2.2.1 - 1.2.2.3中所述进行胰蛋白酶消化。
   3. 除去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 还原血清培养基（例如 Opti-MEM）中。用血细胞计数器计数细胞，取10⁶ 个细胞进行细胞核切除。以225×g离心5分钟。完全去除上清液。
2. 试剂制备和核切除
   1. 通过混合0.5 mL补充剂和2.25 mL核电极溶液（均在试剂盒中提供）来制备核电极试剂。
   2. 在1.5mL管中加入100μL核电极溶液。将pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL各1μg加入试管中。在此混合物中轻轻重悬10⁶ 个细胞（从步骤3.1.2开始）。
   3. 将细胞DNA悬浮液转移到比色皿中，确保样品覆盖比色皿的底部（在试剂盒中提供）没有任何气泡。盖上比色皿并插入支架。选择核电筒程序U-23（用于高效率）并应用。
   4. 从支架中取出比色皿，然后加入 1 mL 完整培养基。将内容物轻轻转移到装有4mL完整培养基（共5mL培养基）的60mm组织培养皿中。将细胞在37°C的加湿CO₂ 培养箱中孵育。
   5. 24小时后，检查细胞是否附着。完全更换介质。
      注意:细胞核传染的细胞死亡率很高，留下很少的活细胞附着。
   6. 将细胞在完整培养基中保持10天，并在接下来的20天内转向多能培养基。
      注意:定期可视化细胞以跟踪重编程细胞中发生的形态变化（如上皮形态和致密集落形成），以确认实验是否有效。在多能培养基中培养20天后，可以看到大约25个iPSC菌落。

4. iPSC菌落的采摘和繁殖

1. 从重编程板中挑选菌落
   1. 使用拉动的玻璃移液管或1 mL注射器针头手动解剖在重编程皿中形成的胚胎干细胞样菌落，并使用多能培养基将小鼠胚胎成纤维细胞饲养器转移到先前制备的板中，或在具有mTESR培养基的Matrigel涂层板上建立无饲养层培养物。
      注意:小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）使用从小鼠胚胎中酶分离（从怀孕13-14天的雌性小鼠中解剖）衍生出来，并通过丝裂霉素C处理进行有丝分裂灭活。通过将许多菌落从重编程板转移到单个培养皿来建立单克隆种群，或者通过将许多菌落从重编程板转移到单个培养皿来建立混合克隆种群。
2. 将新兴菌落机械转移到新鲜饲养者和传代，以建立稳定的iPSC
   1. 通过每隔一天进食并在多能培养基中传播iPSCs，每5-7天分裂1:3。通过冷冻保存在KnockOut血清替代物和DMSO的冷冻混合物中以9:1的比例制备库存。
      注意:KnockOut血清替代物用于冷冻混合物中，用于iPSCs而不是FBS的冷冻保存，因为FBS中的组分可以在长期保存期间诱导多能细胞的分化。

5. iPSC的表征

注意:包括PCR和多能性生物标志物免疫染色在内的表征研究在第五代号之后进行。核型分析是在后来的段落编号处进行的。

1. 核型分析
   1. 在37°C的加湿CO₂ 培养箱中将iPSCs与colcemid混合的60mm培养皿处理45分钟。
   2. 通过0.05%胰蛋白酶处理和离心收获。除去上清液并移取剩余的培养基痕迹以疏松细胞沉淀。
   3. 加入 5 mL 低渗溶液。通过倒置管混合并在37°C下孵育20分钟。 以225×g离心5分钟。
      注意:获得的颗粒应显得蓬松。
   4. 缓慢加入2.5毫升Carnoy的固定溶液，同时轻敲以松开沉淀。
   5. 通过将细胞悬浮液滴在干净的载玻片上来准备用于核型的涂抹酱。
   6. 用0.15%胰蛋白酶处理载玻片1分钟，并用PBS洗涤一次。然后用Giemsa溶液染色4分钟，最后用蒸馏水洗涤。使用适当的软件进行采集和处理。
2. 无转基因状态的证明
   1. 基因组DNA分离
      1. 将20μL蛋白酶移入1.5mL微量离心管的底部。
      2. 将200μL重悬于PBS中的TSiPSCs加入微量离心管中。
      3. 向样品中加入200μL缓冲液AL，并通过脉冲涡旋混合15 s。
      4. 在56°C下孵育10分钟。
      5. 短暂离心微量离心管以除去盖子内侧的液滴。
      6. 向样品中加入200μL乙醇（96-100%），并通过脉冲涡旋再次混合15秒。混合后，短暂离心管以除去盖子内侧的滴剂。
      7. 小心地将上一步中的混合物涂抹到迷你离心柱（在2 mL收集管中）上，而不会润湿轮辋。合上盖子，以6000×g离心1分钟。丢弃含有滤液的管，并将迷你离心柱置于干净的2 mL收集管中。
      8. 小心打开迷你离心柱，在不润湿轮辋的情况下，加入500μL缓冲液AW1。合上盖子，以6000×g离心1分钟。将迷你离心柱放入干净的2 mL收集管中，并丢弃含有滤液的收集管。
      9. 小心打开迷你离心柱，加入500μL缓冲液AW2，不要润湿轮辋。合上盖子，全速（20，000 x g）离心3分钟。
      10. 将迷你离心柱放入新的2 mL收集管中，并丢弃带有滤液的旧收集管。全速离心1分钟，以消除缓冲液AW2可能残留的可能性。
      11. 将微型离心柱置于干净的1.5 mL微量离心管中，并丢弃含有滤液的收集管。小心打开迷你离心柱，加入200μL缓冲液AE或蒸馏水。在室温（15-25°C）下孵育5分钟，然后以6000×g离心1分钟。
   2. 无转基因状态 PCR（使用 KAPA 高保真聚合酶链试剂盒 KR0368）
      1. 确保所有试剂都正确解冻和混合。
      2. 根据 表2 制备含有适当体积的所有反应组分的PCR预混液（在冰上设置反应）。
      3. 将适当体积的 PCR 预混液、模板和引物转移到各个 PCR 管中。
      4. 盖上单个反应的盖子，混合并短暂离心。
      5. 执行PCR 操作，见表 3。
3. 多能性生物标志物鉴定
   1. 碱性磷酸酶 （AP） 染色
      1. 通过将3μL500x储备溶液稀释在1.5mL DMEM / F-12中，每10^cm 2培养区域，制备1x AP活染色工作溶液。
      2. 从iPSC培养皿中取出培养基。用DMEM / F-12洗涤培养物一次。将 1x AP 活性染色液加入 iPSC 中。在37°C孵育45分钟。
      3. 取出AP污渍，用DMEM / F-12洗涤两次。加入新鲜的DMEM / F-12，并在染色后30-90分钟内使用标准FITC滤光片在荧光显微镜下成像。
   2. 多能性生物标志物的免疫染色
      1. 在4°C下将融合的iPSC培养物与4%多聚甲醛固定过夜。 用PBS吐温20（PBST）洗涤三次，每次洗涤5分钟。
      2. 在室温下用0.3%Triton X-100在PBST中透化细胞15分钟。用PBST清洗三次。
         注意:仅对细胞内抗原进行通透。
      3. 在室温下用3%牛血清白蛋白（BSA）在PBST中阻断细胞30分钟。用一抗（在1%BSA中稀释1:1000）染色细胞过夜。一抗孵育后，用PBST洗涤三次。
      4. 用二抗（在1%BSA中稀释1:1000）在室温下孵育细胞5小时。用PBST清洗三次。
      5. 用0.5μg/ mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记细胞核1分钟。用PBST洗涤细胞一次。
      6. 在荧光显微镜下捕获图像。

6.体外 分化测定

1. 胚体 （EB） 分化
   1. 将iPSC菌落切成小块，收集并装入胚质体培养基中的低附着培养皿中。通过每3天更换培养基来培养细胞15天。
      注意:第15天的EB可以直接用于检测三个胚层生物标志物。或者，可以用生长因子诱导特定的细胞谱系，然后进行生物标志物检测。
2. 内胚层（肝细胞）分化
   1. 在多能性培养基的单层培养物中培养iPSCs。
   2. 一旦汇合，转至RPMI 1640培养基，加1x亚硒酸盐胰岛素转铁蛋白和100ng / mL激活素A 2天，然后在RPMI 1640培养基中生长，30 ng / mL bFGF和20 ng / mL BMP4持续9天。每 2 天更换一次培养基。
   3. 从第10天开始，用0.1μM地塞米松补充培养基。在第 20 天终止实验。
3. 中胚层（心肌细胞）分化
   1. 在胚状体培养基中0.5%基质凝胶包被的板上平板第8天EB。允许 EB 附加和折叠。
   2. 用20 ng / mL BMP4补充培养基并生长20天。每 2-3 天更换一次培养基。在第 20 天终止实验。
4. 外胚层（神经元）分化
   1. 在胚状体培养基中的2μg/ cm² 胶原IV型包被板上平板第4天EB。允许 EB 附加和折叠。
   2. 第二天，将培养基转移到 DMEM F-12，含 2mg/mL 葡萄糖、1x 亚硒酸转铁蛋白和 2.5μg/mL 纤连蛋白。在第 15 天终止实验。
5. 脑类器官的形成
   1. 在MEF上的35mm组织培养皿中培养TSiPSCs，直到70-80%汇合。切除菌落并收集在15 mL管中。将细胞以225×g离心5分钟。丢弃上清液。
   2. 通过在2mLPBS中重悬来洗涤菌落块，然后离心以除去上清液。
   3. 加入1mL0.05%胰蛋白酶，轻敲管以移走细胞。将管在37°C孵育3-4分钟，以将集落块解离成单个细胞悬浮液。
   4. 用含有10μg/ mL rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632二盐酸盐（ROCKi）的4mL多能性培养基稀释胰蛋白酶，以防止解离诱导细胞死亡。
   5. 离心机得到一个沉淀。弃去上清液并将细胞重悬于含有10μg/ mL ROCKi的2mL胚状体培养基中。
   6. 除去10μL细胞悬浮液进行细胞计数。加入10μL台盼蓝以检测死细胞。使用血细胞计数器计数细胞。
   7. 将适当体积的含有ROCKi的胚珠状体培养基加入细胞悬浮液中，以获得每150μL9，000个活细胞。
   8. 在低附着96孔板的每个孔中加入150μL板，并在37°C的加湿CO2培养箱中孵育。 24小时后检查板是否聚集。在第2天，轻轻取出培养基，并用不含ROCKi的新鲜胚芽培养基代替。
   9. 在第6天，将EB转移到含有500μL神经诱导培养基的低连接24孔板的孔中，该培养基由DMEM-F12组成，其中含有1%N2补充剂，2mM GlutaMAX补充剂和1mM非必需氨基酸和1μg/ mL肝素。每 2 天更换一次培养基。
   10. 在神经诱导培养基中5天后，通过将2 cm x 2 cm见方的parafilm分层在200μL尖端的空尖端托盘上，将神经上皮聚集体嵌入Matrigel中。用戴着手套的手指将胶片压在尖端托盘的每个孔上，以产生小凹痕。用70%乙醇清洁副膜以进行灭菌。
   11. 将石板方块转移到60毫米的培养皿中。使用切割的200μL尖端将神经上皮聚集体转移到副膜中的凹痕上。通过移液去除多余的培养基。
   12. 在神经上皮聚集体上加入30μL解冻的基质胶，并使用移液器吸头将聚集体置于基质胶的中心。将60mm培养皿置于37°C培养箱中20-30分钟，以使基质凝胶聚合。
   13. 加入5 mL由1:1 DMEM-F12组成的脑类器官分化培养基:神经基础培养基，0.5%N2补充剂，2.5μg/ mL胰岛素，2mM GlutaMAX补充剂，0.5mM NEAA，1%B27补充剂和2.5mL青霉素链霉素。
   14. 使用无菌镊子将副膜片翻转并搅拌培养皿，直到基质凝胶嵌入的聚集体从片材上掉落到培养基中。将嵌入的聚集体在37°C的加湿CO₂ 培养箱中培养4天，隔天更换培养基。
   15. 静态培养4天后，将60mm培养皿置于安装在培养箱内的轨道振荡器上，以50rpm振荡。每 3 天培养一次类器官，使用脑类器官分化培养基进行 3 个月完全改变培养基。

结果

从具有45XO核型的自发流产胎儿中生成无整合的iPSC
我们从具有特纳综合征（TS）特异性45XO核型的FCV中分离出成纤维细胞，并用外显体重编程质粒对其进行核感染，以产生可用于综合征下游建模的TSIpSC，特别是相关的神经功能缺陷（图1a&b）。我们使用非整合的表观载体和核检点进行转染实验（图1 c&d）。我们跟踪?...

讨论

生成细胞遗传学异常胎儿组织的稳定细胞模型对于使有缺陷的表型永久化是必要的。iPSC途径是永久保存缺陷特性的最有效的细胞制备方法^20。

多能干细胞（PSC）显示出自我更新和分化成特化细胞的特性，让人联想到早期裂解胚胎^21。因此，PSC可以作为研究过早流产胎儿的早期分子，细胞和发育缺陷的优秀模型。

在本文?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	-	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays