评估具有FRET敏化发射的活细胞中的蛋白质相互作用

摘要

两个荧光团分子之间的福斯特共振能量转移（FRET）可用于研究活细胞中的蛋白质相互作用。在这里，提供了有关如何通过使用共聚焦激光扫描显微镜检测受体的敏化发射和供体分子的淬灭来测量活细胞中的FRET的协议。

摘要

福斯特共振能量转移（FRET）是从激发的供体到受体分子的能量的无辐射转移，取决于分子的距离和方向以及供体发射和受体吸收光谱之间的重叠程度。FRET允许研究活细胞中蛋白质随时间变化和不同亚细胞区室中的相互作用。文献中已经描述了使用显微镜测量FRET的不同基于强度的算法。在这里，提供了一种协议和算法，用于基于测量受体的敏化发射和供体分子的淬灭来量化FRET效率。活细胞中比例FRET的定量不仅需要确定荧光蛋白的串扰（光谱溢出或渗漏），还需要确定显微镜装置的检测效率。此处提供的协议详细说明了如何评估这些关键参数。

引言

基于显微镜的福斯特共振能量转移（FRET）分析允许评估活细胞中蛋白质之间的相互作用。它提供空间和时间信息，包括有关细胞中发生相互作用的位置和亚细胞区室中发生以及这种相互作用是否随时间变化的信息。

Theodor Förster于1948年奠定了FRET的理论基础¹.FRET是从激发的供体到受体分子的能量的无辐射转移，取决于分子的距离及其过渡偶极子的相对方向以及供体发射和受体吸收光谱之间的重叠。能量转移速率与供体-受体距离的六次方成反比。因此，FRET可用于测量1-10nm范围内的分子接近度。

FRET与供体分子的其他去激发过程竞争，并导致受体的所谓供体淬灭和敏化发射。供体猝灭是发射供体光子数量的减少，而敏化发射是发射受体光子的增加。许多显微FRET分析使用荧光强度测量，包括受体光漂白2，供体光漂白²或受体3的FRET敏化光漂^白。

在这里，提出了一种分步实验方案和数学算法，以使用供体淬灭和受体敏化发射^4，5（通常称为比率FRET）来量化FRET....

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研究方案

1. 质粒构建

1. 为了生成eGFP-mCherry1融合探针，使用N1哺乳动物细胞表达载体（参见材料表），使用限制性位点AgeI和BsrGI插入mCherry1¹⁰。
2. 使用以下寡核苷酸在没有终止密码子的情况下扩增 eGFP¹¹ 作为 SalI-BamHI 片段:N 末端引物 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' 和 C 末端引物 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'。
3. 将该 SalI-BamHI 片段插入N1载体的多个克隆位点，以在绿色和红色荧光蛋白之间引入RNPPV接头（五个氨基酸）接头。
   注意:该接头产生GFP-Cherry供体-受体对的平均FRET效率约为0.25 -0.3（图1A）。选择不同长度的刚性¹² 和螺旋¹³ 接头来衡量测量的FRET效率已在别处讨论过，但对于我们的融合蛋白目的来说不是必需的。为了简单起见，我们将荧光蛋白称为"GFP"和"樱桃"。

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结果

图1分别显示了在供体通道通道1（488，505-530 nm），转移通道通道2（488，>585 nm）和受体通道3（561，>585 nm）中获得的图像。仅表达GFP，仅表达樱桃，共表达GFP和樱桃以及表达GFP-樱桃融合蛋白的细胞的代表性图像。绘制在表达GFP-樱桃融合蛋白的NRK细胞（阳性对照，图2A）和共表达GFP-樱桃（阴性对照，图2B）的NRK

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讨论

所提出的协议详细介绍了使用基因偶联的一对一荧光蛋白校准探针来量化FRET使用共聚焦显微镜检测受体的敏化发射和供体分子的淬灭。该方法可用于评估不同亚细胞区室中活细胞生理环境中的蛋白质相互作用。通过应用所提出的算法来计算图像每个像素的FRET效率（逐像素FRET），可以进一步提高空间分辨率。基于强度的绝对FRET效率测定需要确定串扰，此处用 S 因子量化，以及通过给定的显.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Clontech mCherry N1 vector	Addgene	3553
DMEM without phenol red	Thermo Fisher Scientific	11054020
Fugene 6	Promega	E2691
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
LabTek 8-well chambers #1.0	Thermo Fisher Scientific	12565470
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081