使用经颅功能超声成像的小鼠全脑3D激活和功能连接映射

摘要

该协议描述了使用功能超声（fUS）定量小鼠大脑中体积脑血流动力学变化的方法。在麻醉和清醒的小鼠中，提供了感觉刺激后的3D功能激活图以及静息状态功能连接的程序作为说明性示例。

摘要

功能超声 （fUS） 成像是一种新型的脑成像方式，它依赖于超快多普勒血管造影实现的脑血容量的高灵敏度测量。由于脑灌注与局部神经元活动密切相关，因此该技术允许全脑3D映射任务诱导的区域激活以及静息状态功能连接，非侵入性，具有无与伦比的时空分辨率和操作简单性。与fMRI（功能性磁共振成像）相比，fUS成像的主要优点在于能够与清醒和行为动物实验完全兼容。此外，小鼠的fMRI大脑映射是神经科学中最常用的临床前模型，由于大脑体积小且难以维持稳定的生理条件，因此在技术上仍然具有挑战性。在这里，我们提出了一种简单，可靠和强大的方案，用于麻醉和清醒小鼠的全脑fUS成像，使用带有电动线性换能器的现成商用fUS系统，在感觉刺激后产生显着的皮质激活以及用于网络识别的可重复的3D功能连接模式。

引言

在过去的二十年中，神经成像已成为研究大脑功能和组织的重要工具，使研究人员能够在神经科学领域取得重要发现。今天，功能性磁共振成像（fMRI）已成为评估任务或药物诱发的大脑激活并绘制静止时功能连接的金标准临床神经成像技术。虽然人类fMRI具有很高的可靠性和敏感性，但由于多种原因，小鼠fMRI在技术上仍然具有挑战性¹。首先，fMRI的空间和时间分辨率较差。小鼠大脑的小尺寸需要使用昂贵的扫描仪使用强磁场来实现合理的空间分辨率。其次，在狭窄的范围内保持稳定的生理参数，允许有效的神经血管耦合在麻醉小鼠中是非常困难的。最后，fMRI研究所依赖的血氧水平依赖性（BOLD）信号具有相对较差的灵敏度，导致应用于小鼠时信噪比较低，并且通常需要在长时间采集期间反复出现刺激以检测小的变化。小鼠是生物医学临床前研究中使用最广泛的动物模型，这些局限性是神经精神病学转化差距的部分原因，阻碍了工作台上新的有希望的治疗靶点被转移到床边的有效治疗中。

功能超声（fUS）是最近开发的一种基于超快多普勒^2的神经成像技术。通过直接采样脑血容量，该技术允许通过神经血管耦合实时探测大脑活动。与其他神经成像技术相比，fUS产生的空间分辨率为100μm，时间分辨率为数十毫秒。该技术允许对小鼠大脑的完整冠状部分进行全脑成像，完全非侵入性。此外，它与有意识和行为行为的动物^3，4，5完全兼容。fUS目前的主要限制之一是其2D功能，允许同时记录单个日冕平面。虽然使用2D矩阵阵列换能器的体积3D fUS已经在大鼠⁶中成功证明并在小鼠⁷中得到证实，但其目前缺乏灵敏度需要全开颅手术以及平均大量试验来检测活性的轻微变化。或者，线性换能器可以跨越多个位置，并逐个平面执行功能成像，以覆盖整个大脑。然而，这种技术需要无数的实验范式重复，因此采集时间很长（小鼠大脑为3-4小时^）8，9。

在目前的工作中，我们描述了一个强大的实验平台，包括一个市售的功能性超声扫描仪和一个快速平面切换线性换能器，其程序是在麻醉和清醒的小鼠中获取3D fUS数据，允许小鼠大脑的体积和经颅功能映射，非侵入性，没有造影剂，并且在较短的采集时间内。我们通过映射晶须刺激后的躯体感觉皮层激活以及静息状态功能连接来说明这一特征。除了动物制备和数据收集外，我们还描述了实时fUS信号的可视化，图集配准和分析的程序。

研究方案

此处提出的所有程序均按照2010年9月22日的欧洲共同体理事会指令（010/63/UE）和我们的地方道德委员会（第59号"巴黎中心和南部"，项目#2017-23）执行。成年小鼠（雄性C57BL / 6 Rj，年龄2-3个月，20-30g，来自法国Janvier Labs）每个笼子饲养4只，具有12小时的光/暗循环，恒温在22°C，食物和水随意。在实验开始之前，动物被给予一周的最低适应期，以适应住房条件。

1. 用于麻醉fUS成像的动物制剂

1. 麻醉
   1. 称量鼠标。
   2. 在无菌盐水中分别以10mg / mL和2mg / mL制备氯胺酮和西噻嗪的混合物。使用 26 号针头和 1 mL 一次性注射器腹膜内给药 0.2 mL 氯胺酮/木肼嗪溶液。几分钟后，将动物放在立体塔架上，确保头部是平的。
   3. 给予第二体积的麻醉剂，以达到100mg / kg氯胺酮和20mg / kg木拉嗪的总剂量（考虑到初始剂量）。
      注意:麻醉应持续1小时。为了长时间保持稳定的镇静，腹膜内每30分钟注射0.05mL氯胺酮/木肼嗪混合物。
2. 麻醉成像的动物准备
   1. 在小鼠眼睛上涂抹一些眼药膏（例如，Ocry-Gel），以避免在成像过程中形成任何白内障。使用修剪器剃须鼠标头。涂抹一些脱毛霜，几分钟后冲洗干净。重复此步骤，直到头发完全脱落。
   2. 在四肢中插入皮下插针以进行心电图（ECG）记录。将离心超声凝胶（1500转/分，5分钟）放在头上。
   3. 在整个实验期间监测麻醉深度（包括麻醉诱导）。通过使用与直肠探头耦合的加热毯将动物的温度保持在37°C。
   4. 监测以下生理参数，这些参数是麻醉深度的间接指标:心率（每分钟220-250次 - 通过皮下植入的心电图薄电极监测）和呼吸频率（每分钟130-140次呼吸 - 使用连接到ECG采集系统的肺活量计监测）。
      注:实验设置的说明如图 1所示。

图1:麻醉fUS实验的实验设置。实验设置的描述显示了麻醉实验期间所需的所有科学设备。1.生理监测:实时显示呼吸和心脏频率。2.由Iconeus One系统（9）监测的四轴电机模块（三平移和一次旋转），并允许执行经颅3D断层扫描或4D采集。3a.伺服电机驱动晶须刺激器（3b.）伺服电机由arduino uno卡控制，该卡与Iconeus One系统（9）连接，以便将刺激模式与成像序列同步。4.a.注射泵控制器。4.b.注射器支架。5.a.温度板监视器控制加热板。5.b.加热板和直肠温度计与温度板监视器（5.a.）连接。6.超声凝胶放置在动物头部和超声探头之间，提供它们之间的声耦合。7. 15 MHz超声探头。8.探头支架将探头（7）连接到电机模块（2）。9. Iconeus 一个设备和软件，允许对不同的成像序列进行编程并控制驱动探头的电机模块（2个）（7个）。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 清醒头固定小鼠实验的动物准备

1. 头板手术
   1. 将麻醉的动物（步骤1.1-1.2）放在加热垫（37°C）的立体定位架中。将保护凝胶涂抹在眼睛上，并使用26号针头在头皮皮肤下施用利多卡因s.c（0.2 mL，2%），并等待几分钟。
      注意:每10-30分钟监测一次麻醉水平，通过对牢固的脚趾捏合的反应（没有）。
   2. 在矢状缝合线后从枕骨后面到鼻骨的起点做一个切口。使用手术剪刀切除两个半球的皮肤。
   3. 用1%碘溶液清洁颅骨，并去除任何剩余的骨膜。使用头板作为模板，在颅骨上钻两个孔（直径1毫米）以定位锚固螺钉。
      注意:注意不要完全钻穿颅骨，以避免任何脑损伤或硬脑膜炎症
   4. 用螺钉定位头板。使用牙科水泥将螺钉和头板固定在框架的前面和后面，以保持植入物的良好抓地力。
      注意:注意不要在框架窗口内涂水泥，因为这会大大降低信号质量。用一层薄薄的手术胶水覆盖颅骨，以保护骨骼并密封成像窗口侧面的伤口。
   5. 在水泥干燥后，将动物从立体定位架上取出，并通过皮下注射阿替帕唑（1mg / kg）逆转麻醉。针对术后疼痛，预防性给予美洛昔康（5 mg/kg/天，s.c）。
   6. 将动物放在加热垫（37°C）上的恢复笼中。老鼠可以在几个小时内带着幼崽回到家笼子里。在头板上放置一个磁性3D打印的盖子（带有磁铁嵌件的聚己酸材料）以进行保护（图2A）。在开始适应移动房屋笼子（MHC）之前，让鼠标恢复4至6天。
      注:瓶盖和顶板的总重量为2.8克。
2. 处理和习惯
   1. 在恢复后（PR）的第1天，轻轻地将鼠标握在手中5-10分钟，每天几次。
   2. 在第2天PR中，重复处理，如第1天一样，让动物自由探索MHC5-10分钟。
      注意:在房间里播放一些背景音乐可以帮助减轻动物的压力。
   3. 在第3天的PR中，让动物自由探索MHC5-10分钟。之后，小心地抓住头板并将其轻轻地放在夹具中，手动移动碳笼以陪伴鼠标。将动物固定在头部固定位置5-10分钟。在训练课之间用70%乙醇溶液清洁MHC，并用自来水冲洗。
      注意:确保 MHC 按照制造商的建议接收到足够的气流。头部夹的高度需要手动调整，以提供舒适的位置。
   4. 在第4天和第5天PR中，反复夹住小鼠MHC并逐渐增加头部固定时间，从5分钟开始，直到30分钟。在成像窗口上涂抹一些生理盐水和超声凝胶以习惯。
   5. 在第6天PR，重复第4/5天PR的实验方案，并按照步骤3.1将探针放置在动物头部上方。
   6. 在实验当天，如上所述进行。然后，用生理盐水加湿成像窗口并应用一些超声凝胶。开始跟踪动物并继续探头定位（见下文）。
      注意:MHC中的夹紧也可以通过将鼠标包裹在抹布中来完成。在这种情况下，小鼠在头部固定之前需要习惯于包裹程序。 图2B提供了用于清醒成像的完整实验设置的描述。

图2:清醒fUS实验的实验设置。一个。 保护成像窗口的头板磁性盖的示意图（使用 BioRender.com 创建）。在成像过程中（左），盖子被取下，以在头板提供的大孔中扫描大脑。 二. 头部固定自由行为小鼠经颅清醒成像实验装置的照片。 1. Iconeus One系统和软件，允许设置不同的成像序列并控制电机模块。 2. 四轴电机模块（三平移和一转）由Iconeus One系统（1）监控，并允许3D断层扫描或4D采集。 3. 空气分配台。 4. 移动房屋笼（MHC）。 5a，5b. 照片显示了MHC内动物环境的近距离视图。 6. 头部固定系统夹紧头板。 7. 探头支架将探头与电机模块（2）连接起来。 8. 15 MHz超声波探头。 9. 超声凝胶放置在小鼠头和超声探头之间，提供它们之间的声耦合。 10. 伺服电机驱动晶须刺激器。伺服电机由Arduino Uno卡控制，该卡通过TTL信号（1）与Iconeus One系统连接，以使刺激模式与成像序列同步。 三. 说明不同的空间采样可能性（使用 BioRender.com 创建）:在每种情况下，探头从第一个位置步进到最后一个位置，并在每个位置记录多普勒图像以重建堆叠体积。在整个采集过程中，此过程不断重复。密集扫描（左）:切片之间的步长必须足够小（通常为400μm，对应于仰角分辨率）以允许体积成像。稀疏扫描（右）:如果以远处的功能区域为目标（在不同的位置），也可以减少空间采样，以对与这些区域相交的不同切片进行成像，同时不影响时间采样。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 探头定位

1. 启动软件（例如，IcoScan）并创建实验会话。转到 "移动探头 "菜单，使用导航键盘调整超声探头的位置。
   注意:探头应放置在动物头部上方约1毫米处。在开始任何成像序列之前，确保探针与超声凝胶接触至关重要。
2. 开始 实时取景 ，并在需要时通过动物CBV（脑血容量）的实时成像来调整探针位置。将大脑对齐在图像的中心。优化成像参数以捕获最高的信噪比。
   注意:在清醒的小鼠实验中，需要减小孔径大小以避免由侧向肌肉收缩引起的伪影。

4. 血管造影扫描和地图集配准

1. 在采集软件中打开Angio 3D选项。在预设面板上，调整扫描参数（第一片，最后一片和步长）以扫描整个大脑（图3A，B），并开始采集。
   注意:设置扫描参数时，请确保扫描将覆盖大脑的后部
2. 将采集软件保持打开状态，启动软件进行数据分析和可视化（例如，IcoStudio），然后加载血管 3D 扫描。使用3视图面板浏览采集体积，然后选择 日冕扫描方向:前后或后前。
3. 转到 大脑注册面板。加载注册过程所需的鼠标参考模板。使用全自动或手动配准模式在 Allen 鼠标通用坐标框架 上注册扫描（图 3C）。
4. 通过查看血管 3D 扫描和参考模板的叠加，或使用 Atlas 管理器 面板查看扫描和 Allen 参考图集的叠加来检查结果（图 3D）。将注册另存为 .bps 文件。
   注意:注册文件可以重复用于在同一实验会话期间执行的任何其他采集。

5. 大脑定位系统

1. 在IcoStudio软件中，确保加载了血管造影扫描及其.bps文件（在 步骤4.4中生成）。
2. 转到 大脑导航面板。在 "Atlas 管理器 "面板中，使用父/子树导航器浏览鼠标 Allen 脑图集 。找到解剖学目标区域并选择它们以将它们叠加到3视图中的扫描中。
3. 在 3 视图面板中可视化目标区域，并选择与实验的目标区域重叠的成像平面。为此，请在日冕位置手动设置两个标记，其中包括感兴趣的区域。
4. 单击 大脑定位系统 （BPS）以提取生成的运动坐标。这些坐标对应于允许对目标平面进行成像的探头位置。检查从血管造影扫描中计算出的图像的预览。
5. 在IcoScan软件中，进入 探头定位 面板，然后单击 输入BPS坐标。应用 步骤 5.4中给出的坐标。探头在目标成像平面上移动和对齐。
6. 执行实时取景并检查当前成像平面是否与 步骤5.4中给出的预测相对应。
   注意:也可以选择矢旁/非正交平面。

图3:快速经颅血管造影扫描和脑配准，用于精确定位探针。一个。 在快速血管造影扫描期间，由超声探头从第一个日冕切片（绿色）到最后一个日冕切片（蓝色）经颅扫描的小鼠大脑的示意图。当前成像的切片（以红色表示）从大脑的背面（绿色）到前部（蓝色）一步一步地移动。使用 BioRender.com B. Angio 3D 面板中 IcoScan 采集软件的屏幕截图创建。右侧的预设参数可配置快速扫描。必须正确选择第一个切片，最后一个切片的位置（以毫米为单位）以线性扫描整个大脑。 三. IcoStudio 处理软件的屏幕截图。快速的Angio 3D扫描会自动注册到小鼠大脑的参考模板中。三视图（左）显示了脉管系统和小鼠脑艾伦图谱在日冕、矢状和轴向视图中的叠加。 四. 来自3D血管造影扫描的16个切片（共31个）的线性布局（蒙太奇），注册的Allen参考图谱叠加到脉管系统上。 E. 大脑导航面板的屏幕截图显示了对应于软件计算的运动坐标的预测成像平面，这要归功于放置在左右初级躯体感觉皮层中心的两个标记，桶场区域。请点击此处查看此图的放大版本。

6. 任务诱发实验:晶须刺激

1. 预先定义刺激顺序，包括刺激时间、刺激间时间和重复次数。
2. 通过定义采集的总时间、位置数以及位置之间的死区时间来运行 3D fUS 序列。如果通过TTL输入与采集系统同步的自动刺激，请在开始采集之前选择 Trig-IN 选项。
   注意:对于这项工作中的结果，使用棉签进行刺激，例如允许大多数晶须在背侧/腹侧方向偏转。它被固定在由Arduino UNO卡驱动的伺服电机上，连接到Iconeus One系统以确保同步。推荐的刺激参数为 30 s ON、30 s OFF、振幅为 20° 和 4 Hz 频率。或者，也可以通过在采集过程中在定义的时间偏转晶须来手动提供刺激。
3. 在IcoStudio软件中打开采集，然后进入 激活地图 菜单。使用开始时间和结束时间填充激活模式字段，并计算激活映射。调整显示参数以进行可视化。将激活映射导出为 .h5 文件以进行脱机分析。
   注意:使用广义线性模型（GLM）方法估计激活，其刺激由默认小鼠血流动力学反应（HRF）卷积。或者，可以通过估计刺激模式与来自每个体素的血流动力学信号之间的Pearson相关性来直接可视化激活。

7. 4D功能连接

1. 通过定义采集的总时间、成像平面位置的数量以及位置之间的死区时间来运行 3D fUS 序列。
   注意:对于 4D 功能连接，我们建议每个体积之间的采集时间< 2.5 秒（采样频率至少为 0.4 Hz），总采集时间至少为 10 分钟（时间点数> 180）。
2. 保存采集并将其加载到IcoStudio软件中。如有必要，请加载 .bps 文件和 Allen 鼠标大脑坐标框架。在 地图集管理器中，选择地图集的区域作为感兴趣区域 （ROI）。
3. 进入 功能连接 菜单，然后在 ROI 管理器中选择所需的区域。将结果可视化为连通性矩阵（监督分析）或基于种子的相关性图（无监督）。根据需要选择并调整带宽滤波器，并导出相关结果以进行统计分析。
   注:在3D fUS成像模式下，相对探头位置是手动设置的。因此，可以根据功能应用选择两种类型的扫描:密集扫描与稀疏扫描（图2C）。

结果

该协议描述了小鼠大脑中经颅，静止或响应感觉刺激时脑血流动力学变化的3D定量。胡须刺激是绘制啮齿动物大脑功能激活的标准范例，已被选为感觉刺激诱发电应的一个例子。 图4 显示了使用经颅fUS成像获得的麻醉小鼠中响应机械晶须刺激的代表性激活图。总试验时间为760秒，基线为60秒（刺激前后），刺激时间为80秒，恢复时间为60秒，重复5次。使用默认小鼠血流动力学反应函数（HRF）的一般线性模型（GLM）的分辨率确定显着激活。激活的区域（经过严格的 Bonferroni 校正以进行多重比较后，p 值>0.0000006 的 Z 分数）显示为叠加到 Allen 公共坐标框架模板上的颜色编码值。对侧初级躯体感觉皮层的体素时间过程，桶场区域（S1BF）显示，与基线相比，CBV增加了15-20%。

图4:氯胺酮/木拉嗪麻醉小鼠晶须刺激后的经颅激活图和rCBV时间过程。一个。 活化图显示，在氯胺酮/木氮嗪麻醉下机械刺激右晶须（80 s ON，60 s OFF，5x）后，体素显著活化。基于一般线性模型分析（GLM）计算Z得分，并进行邦费罗尼校正以进行多重比较，从而获得地图。Z 评分（颜色编码）叠加在 Allen 脑 3D 模板上（在配准大脑定位系统后），并以三个视图显示:日冕（左）、矢状（中）和轴向（右）。显示艾伦小鼠大脑共同坐标框架的解剖区域以供参考。激活的体素位于左侧S1BF皮层内。比例尺:1毫米。在3.85秒内扫描每个样品体积超过2.8 mm（相当于高程方向的7个切片），从而在每次功能响应期间记录20个体积样品。 B. 与基线水平相比，胡须刺激诱发的相对脑血容量（rCBV）的3D渲染增加。S1BF的解剖学轮廓以蓝色表示。 三. 左侧S1BF（蓝色）中CBV变化的时间过程和施加的相应刺激（红色）。请点击此处查看此图的放大版本。

使用IcoScan的唤醒预设，在移动家庭笼中的头部固定行为鼠标中应用了相同的范例。 图5 显示了使用 图2中描述的实验设置进行多晶须刺激实验后的激活图。用以下模式刺激一些后胡须和尾须:基线30秒，然后连续五次试验30秒ON（4 Hz）和30秒关闭（图5C）。使用由Arduino UNO卡驱动的伺服电机提供刺激，触发图像采集序列以进行同步。使用默认小鼠血流动力学反应函数（HRF）的一般线性模型（GLM）的分辨率确定显着激活。使用Bonferroni方法进行多重比较校正。传统的α水平0.05被采集量中的体素总数归一化，最终的严格阈值为0.000003。

图5:清醒行为小鼠胡须刺激后的激活图和rCBV时间过程。一个。 激活图显示移动家笼中清醒的小鼠在机械刺激右胡须（30 s ON，30 s OFF，5x）后显着激活的体素。通过基于一般线性模型分析（GLM）计算Z得分来获得地图，并带有用于多重比较的Bonferroni校正（通过体素总数归一化）。Z 评分（颜色编码）叠加在 Allen 脑 3D 模板上（在脑定位系统配准后），并以三个视图显示:日冕（左）、矢状（中）和轴向（右）。显示艾伦小鼠脑共同坐标框架中的解剖区域以供参考。激活的体素位于左侧S1BF皮层内。鳞片条，1毫米。在3.85秒内扫描每个样品体积超过1.6 mm（对应于仰角方向的3个切片），允许在每个功能响应期间记录17个体积样品。 B. 与基线水平相比，胡须刺激诱发的相对脑血量（rCBV）的3D渲染增加。S1BF的解剖学轮廓以蓝色表示。 三. 在右胡须刺激实验期间移动家庭笼中的小鼠的插图，在此期间进行了五次30秒的试验，总采集时间为330秒 。 在激活区域内提取瞬时相对CBV时间过程（蓝色），与相应的刺激叠加（红色）。请点击此处查看此图的放大版本。

图6显示了氯胺酮 - 甲苯噻嗪麻醉小鼠中3D大脑区域（从Allen公共坐标框架的注册中识别）之间的归一化低频（<0.2 Hz）自发CBV波动的时间相关性。总采集时间为20分钟（1200秒）。Atlas监督分析揭示了强烈的半球间连通性模式，产生的相关系数值高达0.8。背海马体中基于种子的分析显示，左右海马体以及深海马后区和梨状皮质之间存在显着的半球间连接。如前所述，在S1BF中选择的种子区域也产生了对称（皮质 - 皮质）相关模式。

图6:在氯胺酮/木拉嗪麻醉下小鼠大脑的经颅容量静息状态功能连接，在20分钟的3D fUS采集中评估。一个。 相关矩阵基于在经颅功能采集上注册的艾伦公共坐标框架的3D区域。该矩阵是通过计算切片时序校正后每个已识别的ROI中包含的所有体素的平均时间信号的自发低频波动（<0.1 Hz）的归一化皮尔逊相关性而获得的。在2.2 s.B上获得的高度方向（相当于4个切片）扫描超过1.6 mm的每个采样体积。投影到 3D 模板上的基于种子的分析。种子在β - 2.1毫米的右背海马体内选择。通过计算切片时序校正后种子的时间信号与整个采集的每个体素之间的皮尔逊相关系数，得到相关图。 C. 基于种子分析的3D相关图，在S1BF中选择的种子区域为β - 2.1 mm。比例尺:1 毫米。请单击此处查看此图的放大版本。

讨论

全脑成像方法是更好地了解大脑生理学和病理学的重要工具。这里描述的方法允许直接在工作台上精确定量活体大脑中的血流动力学信号。功能超声无与伦比的灵敏度和时空分辨率特别适合小鼠生理学。功能响应和静息状态网络可以在较短的采集时间内纵向映射，而无需平均试验或受试者以获得可靠的测量结果。高灵敏度超声线性探头和快速电动设置的相关组合使人们能够在合理的采集时间内对小鼠进行经颅体积fUS成像。该协议可以使用移动家庭笼子在麻醉或清醒的小鼠上进行。

胡须刺激，在本手稿中用作说明性示例的感觉刺激，是啮齿动物的标准功能激活范式，也是研究感觉处理，神经血管耦合及其改变的可靠读数^{5，6，10，11。}虽然粗手动刷须可能因其易用性而更受欢迎，但这种方法缺乏空间和时间精度。使用自动刺激器（例如此处描述的由fUS成像扫描仪触发的刺激器）可以更好地控制多个参数，包括发病时间，振幅位移，频率以及Q-tip/梳子的角度，从而获得更好的动物间可重复性。此外，更精确的刺激时间可以通过确定发病时间和峰值时间^{参数12，13}来模拟血流动力学反应函数（HRF）。为了确保在刺激期间偏转的晶须数量（以及激活区域的面积）的精度更高，更复杂的刺激器可以适应该协议。许多其他刺激，如光^8、声音¹⁴或气味呈现^15，可以使用相同的协议来实现。

与其他神经影像学技术相比，功能超声与清醒和行为正常的动物的兼容性是一个重要优势，可以在没有麻醉偏倚的情况下实现功能激活映射。使用气举式移动家庭笼是其他现有头部固定设备（如线性或球形跑步机）的良好替代方案。在牢固地固定头部的同时，家笼的运动使鼠标具有在环境中导航的错觉，从而可以将广泛的行为测试与fUS成像^相结合16。然而，头部固定的习惯化程序是减少压力的重要步骤，特别是对于可以将其视为混杂因素的实验。这里详述的程序（6天的处理和头部固定习惯）为感觉刺激和静息状态功能连接提供了可靠的结果。但是，可能需要延长习惯期以进行更精细的行为测试^17。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Plastipak 1 mL syringes	Dutscher, France	303172
BD Microlance 26 Gauge needles	Dutscher, France	303800
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)	Physitemp	TCAT-2DF
Arduino	Arduino	Arduino Uno-Rev3
Atipamezole	Orion Pharma, France	Antisedan®	5 mg/ml injectable solution
Dental Ciment	Sun Médical, Shiga, japan	Superbond C&B
Depilatory cream	Klorane	N/A
Eye Ointment	TVM, UK	Ocry-gel
Hair trimmer	Wella Profesionnals	N/A
Head plates	Neurotar, Finland	Model 14
Iconeus One standard package for fUS	Iconeus, France	Iconeus One
IcoScan acquisition software (v1.0)	Iconeus, France	IcoScan
IcoStudio analysis software (v1.0)	Iconeus, France	IcoStudio
Isoflurane Anesthesia station	Minerve, Esternay, France
Ketamine	Virbac, France	Ketamine1000	100 mg/ml injectable solution
Lidocaine	Vetoquinol	Lurocaine®	20 mg/ml injectable solution
Medetomidine	Orion Pharma, France	Domitor®	1 mg/ml injectable solution
Meloxicam	Boehringer lingelheim	Metacam®	0.5 mg/ml injectable solution
Mobile HomeCage Large with tracking capability	Neurotar, Finland	MHC-L-T-V4
Monitoring of ECG and breathing rate	AD Systems, (USA) and LabChart software
Servomotor	Feetech	FT90B
Stereotaxic frame	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Using Mouse Adaptor  (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)
Surgical glue	3M, USA	Vetbond
Syringe Pump	KD Scientific, USA	Legato® 130, Cat# 788130
Ultrasound gel	DREXCO medical, France	Medi'Gel
Xylazine 2%	Bayer, France	Rompun®	20 mg/ml injectable solution