从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析

摘要

本研究描述了一种分离小鼠棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析的新方法。

摘要

棕色脂肪组织（BAT）负责哺乳动物的非颤抖产热，棕色脂肪细胞（BA）是BAT的功能单位。BAs含有多房脂滴和丰富的线粒体，它们表达解偶联蛋白1（UCP1）。BA根据其起源分为两种亚型：胚胎衍生的经典BA（cBA）和白色脂肪细胞衍生的BA。由于其密度相对较低，传统的离心方法无法从BAT中分离出来。本研究开发了一种从小鼠中分离BA进行基因和蛋白质表达分析的新方法。在该协议中，用胶原酶和分散酶溶液消化成年小鼠的肩胛间BAT，并用6%碘沙醇溶液富集解离的BA。然后用Trizol试剂裂解分离的BA，以同时分离RNA、DNA和蛋白质。RNA分离后，裂解物的有机相用于蛋白质提取。我们的数据显示，6%碘沙醇溶液有效地富集了BAs，而不会干扰后续的基因和蛋白质表达研究。血小板衍生生长因子（PDGF）是一种调节间充质细胞生长和增殖的生长因子。与棕色脂肪组织相比，分离的BAs具有显着更高的 Pdgfa表达。总之，这种新方法为在单细胞类型水平上研究棕色脂肪细胞的生物学提供了一个平台。

引言

小鼠和人类都有两种类型的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）¹。WAT以甘油三酯的形式将能量储存在白色脂肪细胞中，BAT的棕色脂肪细胞（BAs）以热量的形式耗散化学能²。根据其发育起源，BA进一步分为胚胎发育过程中形成的经典BA（cBA）和白色脂肪细胞衍生的BA（米色/白细胞，在应激条件下从白色脂肪细胞转化而来）³。BA是多房的，表达产热蛋白解偶联蛋白1（UCP1）⁴。肩胛间蝙蝠（iBAT）储存库是小型哺乳动物⁵的主要cBAs储存库之一，而米色细胞分散在WAT⁶内。

由于其耗散能量的性质，BAs作为减少肥胖的治疗靶点而受到广泛^关注7。为了利用BA治疗肥胖症，必须了解控制BA功能，存活和募集的分子机制。脂肪组织包括BAT和WAT是异质的。除脂肪细胞外，脂肪组织还含有许多其他细胞类型，例如内皮细胞，间充质干细胞和巨噬细胞⁸。尽管存在特异性消耗小鼠BA候选基因的遗传工具，例如UCP1：：Cre系⁹，但从BAT或WAT纯化BA的技术有限，....

研究方案

所有小鼠均在无病原体条件下饲养，所有程序均由共济会医学研究机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。UCP1：：Cre⁹ 和Rosa 26^tdTomato 小鼠系¹³ 之前已报道。将所有小鼠保持在室温下，进行12小时的光照/黑暗循环。

1. 制备溶液和棕色脂肪组织（BAT）

1. 在 15 mL 离心管中制备消解溶液和分离溶液。
2. 10 mL BAT 消化液：在 10 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中加入 3.5 mg/mL 分散酶 II、1 mg/mL 胶原酶 II 和 10 mM CaCl₂ 以制成 BAT 消化溶液。
3. 10 mL 12% 碘沙醇溶液（分离溶液）：混合 1 mL 10x PBS、2 mL 60% 碘沙醇、0.01 mL 1 M MgCl 2、0.025 mL 1 M KCl、0.1 mL 0.2 M 乙二胺四乙酸 （EDTA） 和 6.865 mL ddH₂ O 以获得 12% 碘沙醇。
4. 对一只 CO₂ 过量的成年小鼠实施安乐死。简而言之，以每分钟10-30%的笼体积的置换_{率填充小鼠} 笼子，5分钟后，通过检查是否没有明显呼吸来确认死亡。
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结果

肩胛间BAT用于褐色脂肪细胞分离的制备
棕色脂肪细胞（BA）分离过程如图 1A所示。从制备BAT和消化/分离溶液到获得分离的BA的整个过程大约需要4小时。

在成年小鼠中，丰富的BAT存在于肩胛间区域。这种肩胛间蝙蝠（iBAT）被肌肉层和WAT覆盖（图1B）。在开始消化程序之前，需要去除肌肉层和WAT以产生干净的iBAT（

讨论

本研究开发了一种分离BAs用于基因和蛋白质表达分析的新方法。

在已发布的BAs分离方案中，使用3%BSA溶液来富集^BAs12。然而，通过该已发表的方案获得的富集BA不能直接用于蛋白质表达分析。这是因为BAs溶液中存在的浓缩BSA会干扰后续蛋白质提取。当富集在3%BSA溶液中的BA用Trizol试剂处理时，会形成粘性蛋白质聚集体，其中大部分不溶于GTPC蛋白质提取过程。此.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging