基于肽矩阵的 HBV 特异性 CD4 T 细胞响应和 HLA-DR 受限 CD4 T 细胞表位的识别分析

摘要

根据乙型肝炎病毒（HBV）衍生肽基质，可在识别乙肝病毒特异性CD4 T细胞表位的同时，对乙肝病毒特异性CD4 T细胞反应进行评估。

摘要

CD4 T细胞在慢性乙型肝炎的发病机制中起着重要作用。CD4 T细胞作为多功能细胞群，根据它们分泌的细胞因子被归类为独特的功能子集：例如，CD4 T帮手1细胞的IFN-γ，CD4 T帮手2细胞的IL-4和IL-13，CD4 T卵泡辅助细胞的IL-21，CD4 T助剂细胞的IL-17。分析乙型肝炎病毒（HBV）特异性CD4 T细胞，基于细胞因子分泌后，乙肝病毒衍生肽刺激，不仅可以提供有关乙肝病毒特异性CD4 T细胞反应的大小的信息，还可以提供有关HBV特异性CD4 T细胞功能子集的信息。新的方法，如转录学和代谢学分析，可以提供关于HBV特异性CD4 T细胞的更详细的功能信息。这些方法通常需要基于肽主要组织相容性复合II多默的活性HBV特异性CD4 T细胞进行分离，而目前有关HBV特异性CD4 T细胞表位的信息有限。基于乙肝病毒衍生肽基质，开发出一种利用慢性乙肝病毒感染患者的周围血单核细胞样本同时评估HBV特异性CD4 T细胞反应和识别HBV特异性CD4 T细胞表位的方法。

引言

目前，有3种主要方法分析抗原特异性T细胞。第一种方法基于T细胞受体和肽（同位素）之间的相互作用。抗原特异性T细胞可直接沾染肽主要组织相容性复合物（MHC）多元体。这种方法的优点是，它可以获得可行的抗原特异性T细胞，适合下游转录学/代谢学分析。这种方法的一个局限性是，它不能提供有关整个T细胞对特定抗原的反应的信息，因为它需要验证表位肽，而目前特定抗原的识别表位数量有限。与乙肝病毒（HBV）特异性CD8T细胞表位相比，目前发现的HBV特异性CD4 T细胞表位较少^，使得该方法目前不太适用于HBV特异性CD4 T细胞的分析。

第二种方法是基于抗原肽刺激³后一系列激活诱发的标记物的调高。常用的标记包括CD69，CD25，OX40，CD40L，PD-L1，4-1BB^4。目前，该方法已用于分析接种疫苗的^5、6、人免疫机能丧失病毒感染患者⁷例、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2例感染患者8^例、9例等抗原特异性T细胞^<....

研究方案

书面知情同意从每个患者包括在研究。研究协议符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则，西南医院医学伦理委员会事先批准后就反映了这一点。

1. HBV衍生肽基质的设计

1. 从NCBI数据库（GenBank：AFY98989.1）下载HBV核心抗原的氨基酸序列。
2. 从肽合成服务提供商处购买 HBV 核心抗原衍生肽（由 35 15 mer 肽组成的面板，由 10 种残留物重叠，纯度> 90%，4 毫克/肽）。
3. 设置一个方形 6×6 肽基质，矩阵中每个位置仅包含 1 肽。有12个肽池：6排肽池和6列肽池，每个池5-6肽^16。矩阵中的排肽池和柱肽池代表HBV核心抗原的2个单独的形成。
4. 对于购买的肽中的 3/4，将矩阵的同一行/列中的多肽混合到 12 个单独的肽池中，将它们溶解在一起，以二甲基硫化物 （DMSO） （每个肽 2 μg/μL） 溶解。存储在 -80 °C，用于分析 HBV 特定 CD4 T 细胞响应。
5. 分别溶解其余肽（10 μg/μL），并储存在 -80 °C 以进行表位识别。

2. 周围血单核细胞的分离

1. 从慢性乙肝病毒感染患者身上抽取5mL静脉血。
   注：血量应大致根据肽池的数量加上1个背景控制和1个正控制来估计。分析 1 肽池需要 3 x 1....

结果

细胞因子分泌CD4 T细胞的频率计算为单个生产者和双生产者的总和。 图1显示，TNF-α分泌CD4 T细胞的频率和IFN-γ在背景控制（DMSO）中分泌CD4 T细胞的频率分别为0.154%和0.013%。TNF-α分泌CD4 T细胞的频率和IFN-γ分泌CD4 T细胞的频率分别为0.206和0.017，因此TNF-α分泌CD4 T细胞反应和IFN-γ分泌CD4 T细胞反应的频率均为负数。TNF-α分泌CD4 T细胞的频率和IFN-γ分泌CD4 T细胞的频率分别为2.715%和0.9.......

讨论

本协议中最关键的步骤如下： 1） 足够高生存能力的 PBMC 开始 PC 扩展：2） 适当的 PBMC 扩展环境;3） 在表位识别之前，完全去除 PBMC 培养中的残留肽池。

此协议中的所有分析都取决于 CD4 T 细胞的强劲增殖。一般来说，10天扩展后的PC数量将是初始数量的2-3倍。PBMC 的细胞数和生存能力是 PBMC 扩展的两个关键因素。如果目的只是分析HBV特异性CD4 T细胞而没有表位识别，则合理减?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Bovine V (BSA)	Beyotime	ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α	eBioscience	17-7349-82	Keep protected from light
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER	IHW09126	HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER	IHW09121	HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75)	Corning	430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom)	Corning	3599	Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom)	Corning	3799	Round bottom
Cell Strainer	Corning	CLS431751	Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL)	KIRGEN	KG2611	Sterile
Centrifuge Tube (50 mL)	Corning	430829	Sterile
Centrifuge, Refrigerated	Eppendorf	5804R
Centrifuge, Refrigerated	Thermo	ST16R
Centrifuge, Refrigerated	Thermo	Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set)	BD Biosciences	562574	Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline			Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-03
Filter Tips (0.5-10)	Kirgen	KG5131	Sterile
Filter Tips (100-1000)	Kirgen	KG5333	Sterile
Filter Tips (1-200)	Kirgen	KG5233	Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4	BioLegend	300506	Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780	eBioscience	65-0865-14	Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724	Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer	Brand	718620
HBV Core Antigen Derived Peptides	ChinaPeptides
HEPES	Gibco	15630080	100 ml
Human Serum AB	Gemini Bio-Products	100-51	100 ml
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
KCl	Sangon Biotech	A100395-0500
KH2PO4	Sangon Biotech	A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer	BD
L-glutamine	Gibco	25030081	100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Corning	MCT-150-C	Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers	Scientific Industries	MicroPlate Genie
Mitomycin C	Roche	10107409001
Na2HPO4.7H2O	Sangon Biotech	A100348-0500
NaCl	Sangon Biotech	A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL)	Kirgen	KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8	BioLegend	300914	Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ	eBioscience	12-7319-42	Keep protected from light
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122	100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3	eBioscience	45-0037-42	Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585
Recombinant Human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant Human IL-7	PeproTech	200-07
RPMI Medium 1640	Gibco	C11875500BT	500 ml
Sodium pyruvate,100mM	Gibco	15360070
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR	BioLegend	307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1125