收获和分解:生物膜方法研究中被忽视的步骤

摘要

本文详细介绍了在两种表面类型上展示三种常见生物膜收获和解聚技术的方法，收获方法的坚固性测试以及在选择和优化收获和分解技术以提高可重复性时要考虑的最少信息。

摘要

生物膜方法包括四个不同的步骤:在相关模型中生长生物膜，处理成熟的生物膜，从表面收获生物膜并分解团块，以及分析样品。在这四个步骤中，收获和分解是研究最少的，但在考虑测试偏差的可能性时仍然至关重要。本文演示了在三种不同表面上生长的生物膜的常用收获和解聚技术。从广泛的文献综述中收集的三种生物膜收获和解聚技术包括涡旋和超声处理，刮削和均质化，以及刮擦，涡旋和超声处理。考虑两种表面类型:硬质无孔（聚碳酸酯和硼硅酸盐玻璃）和多孔（硅胶）。此外，我们还提供了在报告所遵循的收获技术时应包含的最少信息的建议，以及检查偏差的随附方法。

引言

生物膜的定义在过去几十年中不断发展，包括微生物与各种生物和/或非生物表面的关联，包括基质中显示不同生长和遗传表达的非细胞成分¹²。生物膜提供保护，免受干燥等环境压力，并可能使化学消毒剂的作用效果降低，从而导致微生物的存活。生物膜中的幸存者可能会提供致病微生物的来源，这些微生物是公共卫生问题³。

生物膜方法由四个步骤组成，生长，处理，采样（收获和分解）和分析。生长是用户确定生物体生长条件、温度、培养基等的第一步，是生物^{膜文献4，5}，^6，7中考虑和报告最多的步骤。该处理步骤评估抗菌剂（例如，消毒剂）以确定其对成熟生物膜^3，8，⁹的功效^，或者可以将抗菌剂掺入表面以确定产物防止或减少生物膜生长的能力¹⁰。第三步，取样，包括从其生长的表面收获生物膜的步骤，并对去除的团块进行分类^3，8，11。第四步，分析，可能包括活细胞计数，显微镜检查，荧光测量，分子结果和/或基质成分评估^8，9。数据评估提供有关实验结果的信息。在这四种方法中，采样通常是最容易被忽视的步骤，因为它假定所选的生物膜收获和/或分解技术是100%有效的，通常无需验证¹¹。

通常被认为是均质的细菌浮游悬浮液在分析之前需要简单的涡旋。然而，生物膜是由微生物（原核和/或真核）、外多糖、蛋白质、脂质、细胞外DNA和宿主细胞组成的复杂群落¹²。需要采取超越传统浮游微生物培养方法的步骤，以便从表面充分收获生物膜，然后将其分解成均匀的单细胞悬浮液。广泛的文献综述（本出版物中未包含的信息）表明，去除和解聚技术的选择取决于许多因素，包括生物膜中存在的物种，生物膜附着的表面（无孔或多孔），生长表面的可及性（易于去除的优惠券或生物膜生长的设备的物理破坏）， 表面几何形状（面积和形状），生长表面上生物膜的密度以及可用的实验室设备。

当从表面收获生物膜时，产生的细胞悬浮液是非均性的。如果要准确枚举这种不均匀的悬浮液，则必须将其分解为单个单元格。活板计数假设菌落形成单元来自一种细菌。如果将生物膜的聚集体放置在生长培养基上，则无法区分可能导致不准确估计的单个细胞。例如，在消毒剂功效测试期间，如果与对照组相比，处理非常有效地从表面上去除生物膜，则与对照组相比，对数减少可能显得人为地大。另一方面，与对照组相比，将生物膜固定在表面上的化学消毒剂似乎具有较低的对数减少^率11。这种类型的情况可能导致对实验数据的偏见解释。

在准备出版时，对文献的回顾确定，收获和分解生物膜的常见方法包括刮擦，拭子，超声处理，涡旋或这些的组合。刮擦被定义为用无菌棒，刮刀或其他工具从表面上物理去除生物膜。擦拭是指用棉签或其他固定吸收材料从表面上去除生物膜。超声处理是指通过分布在水中的超声波破坏表面的生物膜。涡旋是指使用混合器实现管内样品的液体涡流。均质化使用旋转叶片将收获的生物膜团块剪切成单个细胞悬浮液。在本文中，我们提出了两种不同表面类型的收获和解聚方法，即硬/无孔和多孔。

提供了研究人员应在出版物的方法部分包括的建议最低限度信息清单。我们希望包含这些信息使其他研究人员能够重现他们的工作。没有完美的收获和分解方法，因此，还提供了有关如何检查该技术的建议。

本文演示了从常见生长表面收获和分解生物膜的三种常用方法。这些信息将使研究人员能够更好地了解生物膜测试方法的整体精度和偏差。描述的方法如下:（1）在CDC生物膜反应器中高流体剪切下在聚碳酸酯试样（坚硬的非多孔表面）上生长的 铜绿假单胞菌 生物膜在涡旋和超声处理的五步组合后收获和解分解，以实现生物膜收获和解聚（2）铜 绿假单胞菌 在低流体剪切作用下，在滴流反应器中硼硅酸盐玻璃试样（坚硬的非多孔表面）上生长的生物膜被收获并使用刮擦和均质化进行分解（3）在硅胶管（多孔表面）中生长 的大肠杆菌 生物膜被收获并使用刮擦分解，然后进行超声处理和涡旋。

研究方案

1. 涡旋和超声处理

1. 生长成熟的铜绿假单胞菌ATCC 15442生物膜，根据ASTM标准E25622生长。
2. 在48小时生长期结束时，准备根据ASTM标准E28718处理生物膜和样品试样
3. 使用火焰灭菌镊子将高压灭菌的防溅罩无菌插入无菌的50 mL锥形管中。对所有将要接受治疗的管子重复上述步骤。用于控制优惠券的管子不需要防溅罩。
4. 无菌地从CDC生物膜反应器中取出随机选择的棒。冲洗试样，通过将棒轻轻浸入30 mL无菌缓冲水中来去除松散附着的细胞。
5. 将杆平行于工作台顶部，放在空的无菌50 mL锥形管上，并使用火焰灭菌的艾伦扳手，松开固定螺钉，将生物膜涂层的试样放入管中。重复所需数量的优惠券。取下防溅罩，放入单独的容器中进行灭菌。
6. 使用5 mL血清学移液器，将4 mL的治疗或对照组缓慢移液到试管中，使液体沿着管壁内侧流动。
7. 轻轻敲击管的底部，使试样下的任何气泡都被置换。每次添加之间允许 30 - 60 秒。
8. 在指定的接触时间结束时，将36 mL中和剂移液到管中，其顺序与施加处理（或对照）的顺序相同。
   注意:联合处理和中和剂的最终体积对于准确确定生物膜对数密度非常重要。
9. 在最高设置下涡旋每个管子30±5秒。确保实现完全涡旋。
   注意:在可能发生破损的玻璃小瓶中涡旋重试样（例如不锈钢）时，应谨慎行事。
10. 在处理实际样品之前，确定每个浴槽的最佳管数和试管架内的位置。如果处理多个样品，请确认超声处理槽中的水温为21±2 ^oC。
11. 将管子放在悬挂在脱气超声仪中的管架中，使浴中的水位等于管中的液位。以 45 kHz、100% 功率和正常功能超声处理 30 ± 5 秒。重复涡旋和超声检查循环，然后以最终涡旋结束（总共5个循环）。
    注意:这些具有收获和分解的生物膜的管子是¹⁰⁰或0稀释。
12. 在缓冲水中连续稀释样品。使用适当的电镀方法在R2A琼脂上平板。在36±2 ^oC下孵育24小时。根据所使用的电镀方法对菌落进行计数并记录数据。

2. 刮削和均质化

1. 根据ASTM标准E264713培养成熟的铜绿假单胞菌ATCC 15442生物膜。
2. 设置采样站，包括采样板，烧杯中的95%乙醇，酒精燃烧器，止血器，试样去除工具，带有无菌稀释水的烧杯和用于冲洗试样的稀释管。
3. 关闭泵。取下通道盖，并使用无菌试样取出工具和止血剂取出检票，注意不要干扰生物膜。
4. 通过以流体运动轻轻浸入45mL无菌稀释水（包含在50 mL离心管中）来冲洗试样。立即反转动作以删除优惠券。
5. 将试样放入装有45 mL无菌稀释水的烧杯中。使用无菌刮刀或刮刀向下刮擦生物膜覆盖的试样表面约15秒。通过在烧杯中搅拌来冲洗刮刀或刮刀。重复刮擦和漂洗过程3-4次，确保完全覆盖试样表面。
6. 将试样以60°角放在无菌烧杯上，并在试样表面上移液1mL无菌稀释水，以冲洗试样。重复，共冲洗 5 次。烧杯中的最终体积为50 mL。
   注意:联合处理和中和剂的最终体积对于准确确定生物膜对数密度非常重要。
7. 卸下优惠券时，请更换每个通道盖。
8. 在生物安全柜中工作，使刮下的生物膜样品均质化。将无菌均质机探头连接到均质机上，将探针尖端放入液体中，打开均质机并升压至20，500 rpm。
9. 将样品匀浆30秒。调低转速并关闭均质器。
10. 如上所述，通过以20，500 rpm的无菌稀释空白均质化9 mL，持续30秒，对生物膜样品之间的探针进行消毒。将9 mL的70%乙醇管匀浆30秒，分离探针，在乙醇管中静置1分钟。均质化两个额外的稀释坯料。
    注:每个样品均可使用一次性均质探头。
11. 在缓冲水中连续稀释样品。使用适当的电镀方法在R2A琼脂上平板。将板在36±^2oC下孵育24小时，根据所使用的电镀方法适当计数菌落并记录数据。

3. 刮擦、涡旋和超声处理

1. 在硅胶导管中培养成熟的 大肠杆菌 ATCC 53498 生物膜¹⁰。
2. 准备取样材料:冲洗管，无菌离心管，空无菌培养皿，火焰灭菌不锈钢止血器和剪刀，计时器和尺子。
3. 在泵暂停的情况下，使用70%乙醇清洁管道外部。从末端测量 2 cm，避开连接到连接器的区域，并标记卡套管以确定切割位置。
4. 用火焰灭菌剪刀，将管子切成2厘米的标记，然后将管段放入空的无菌培养皿中。用70%乙醇擦拭管子，然后将远端重新连接到废旧管。
5. 冲洗管段以去除浮游细胞。使用火焰灭菌镊子，将管段轻轻浸入 20 mL 无菌稀释水中，然后立即取出。将片段放入 10 mL 中和器中。
6. 使用火焰灭菌镊子，握住管段并用无菌木制涂抹器刮棍刮，直到刮掉管子的所有内部区域。偶尔在10 mL中和剂中冲洗棒，并将管段放回样品管中。刮擦的管段是¹⁰⁰ 或0稀释。
   注意:联合处理和中和剂的最终体积对于准确确定生物膜对数密度非常重要。
7. 在最高设置下涡旋每个管子30±5秒。将管子放在悬挂在超声仪中的管架中，使浴中的水位等于管中的液位。以 45 kHz、100% 功率和正常功能超声处理 30 ± 5 秒。重复涡旋和超声检查循环，然后以最终涡旋结束。
   注意:该管具有收获的和解聚生物膜是¹⁰⁰ 稀释。
8. 在缓冲水中连续稀释样品。使用适当的电镀方法在胰酸大豆琼脂上平板。
9. 将板在36±2 ^oC下孵育24小时。根据所使用的电镀方法对菌落进行计数，记录数据并计算算术平均值。

结果

收获方法的验证/确认
在我们的实验室进行的几项研究检查了涡旋和超声处理的能力，以有效收获使用单管法（ASTM E2871）⁸在生物膜反应器（ASTM E2562）²中生长的生物膜。

根据ASTM E25622在硼硅酸盐玻璃试样上生长铜绿假单胞菌ATCC 15442生物膜。48小时后，将四张试样放入小瓶中，用4mL无菌缓冲水"处理"，?...

讨论

收获和分解方法的最少信息
为了在整个科学界创建可重复的生物膜数据，作者必须尽可能多地提供有关生物膜方法的每个生长，处理，采样和分析步骤的详细信息。生物膜方法的标准化有助于这项工作，因为它允许研究人员参考特定方法和任何相关修改。然而，许多论文只包含一两句话来描述生物膜的收获和分解。为了获得更好的再现性，我们建议在出版物中包括生物膜收获的最?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506