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摘要

该协议描述了用于制备和免疫荧光染色小鼠视网膜平板支架和分析的详细方法。还详细描述了荧光素眼底血管造影（FFA）对小鼠幼崽和图像处理的使用。

摘要

氧诱导性视网膜病变 （OIR） 广泛用于研究缺血性视网膜疾病的异常血管生长，包括早产儿视网膜病变 （ROP）、增殖性糖尿病视网膜病变 （PDR） 和视网膜静脉阻塞 （RVO）。大多数OIR研究在特定时间点观察到视网膜新生血管形成;然而，活小鼠在时间过程中的动态血管生长对于理解OIR相关的血管疾病至关重要，但尚未得到充分研究。在这里，我们描述了诱导OIR小鼠模型的分步方案，强调了潜在的陷阱，并提供了一种改进的方法，以使用免疫荧光染色快速量化血管闭塞（VO）和新生血管形成（NV）区域。更重要的是，我们通过在OIR小鼠模型中进行荧光素眼底血管造影（FFA）来监测活小鼠从P15到P25的血管再生。将FFA应用于OIR小鼠模型使我们能够观察血管再生过程中的重塑过程。

引言

视网膜新生血管形成（RNV）被定义为新的病理血管起源于现有视网膜静脉的状态，通常沿着视网膜内表面延伸并生长到玻璃体（或在某些情况下的视网膜下空间）1。它是许多缺血性视网膜病的标志和共同特征，包括早产儿视网膜病变 （ROP）、视网膜静脉阻塞 （RVO） 和增殖性糖尿病视网膜病变 （PDR）2。

大量临床和实验观察表明，缺血是视网膜新生血管形成的主要原因3，4。在ROP中，新生儿在封闭的培养箱中暴露于高水平氧气以提高存活率，这也是阻止血管生长的重要驱动因素。治疗完成后，新生儿的视网膜经历相对缺氧期5。其他情况见于RVO中中央或分支视网膜静脉的闭塞，并且还观察到视网膜毛细血管的损伤，这是由PDR2中的微血管病引起的。缺氧通过缺氧诱导的因子-1α（HIF-1α）信号通路进一步增加血管生成因子（如血管内皮生长因子（VEGF））的表达，进而引导血管内皮细胞生长到缺氧区域并形成新血管6，7。

ROP是早产儿血管增殖性视网膜病变的一种，是儿童失明的主要原因8，9，其特征是视网膜缺氧，视网膜新生血管形成和纤维增生10，11，12。在1950年代，研究人员发现，高浓度的氧气可以显着改善早产儿的呼吸道症状13，14。因此，氧疗在当时越来越多地用于早产儿15。然而，在早产儿广泛使用氧疗的同时，ROP的发病率逐年增加。从那时起，研究人员将氧气与ROP联系起来，探索各种动物模型以了解ROP和RNV16的发病机制。

在人类中，大多数视网膜脉管系统的发育在出生前完成，而在啮齿动物中，视网膜脉管系统在出生后发育，为研究视网膜脉管系统中的血管生成提供了一个可访问的模型系统2。随着研究的不断进展，氧诱导视网膜病变（OIR）模型已成为模拟缺血引起的病理性血管生成的主要模型。OIR模型的研究中没有特定的动物物种，该模型已经在各种动物物种中开发，包括小猫17，大鼠18，小鼠19，比格犬幼犬20和斑马鱼21。所有模型都具有相同的机制，即它们在视网膜发育早期暴露于高氧，然后返回常氧环境。Smith等人观察到，将小鼠幼崽暴露于P7的高氧中5天会导致中央视网膜血管回归的极端形式，并将它们带回P12处的室内空气中，逐渐触发新生血管簇，向玻璃体生长19。这是一个标准化的OIR小鼠模型，也称为史密斯模型。Connor等人在2009年进一步优化了协议，提供了一种普遍适用的方法来量化VO（血管闭塞）和NV（新生血管形成）的面积，提高了模型22的接受度和利用率。OIR小鼠模型因其体积小、繁殖快、遗传背景清晰、重复性好、成功率高等特点，仍然是现在应用最广泛的模型。

在小鼠中，视网膜血管形成在出生后开始，血管从视神经头向视网膜内向锯齿状动脉内生长。在正常的视网膜发育过程中，第一条视网膜血管在出生时从视神经头发芽，形成一个扩张的网络（初级神经丛），在出生后第 7 天（P7）23 左右到达外围。然后血管开始长入视网膜形成深层，穿透视网膜，并在内核层（INL）周围建立层流网络，就像人类24一样。到产后第三周（P21）结束时，更深的神经丛发育几乎完成。对于OIR小鼠模型，血管闭塞总是出现在中央视网膜中，因为在高氧暴露期间中央区域的大量未成熟血管网络迅速退化。因此，病理性新生血管的生长也发生在中外周视网膜，这是非灌注区和血管区的边界。然而，人类视网膜血管几乎在出生前就已经形成。至于早产儿，当暴露于高氧25，26时，周围视网膜没有完全血管化。所以血管闭塞和新生血管形成主要出现在周边视网膜27，28。尽管存在这些差异，但小鼠OIR模型密切概括了缺血诱导的新生血管形成期间发生的病理事件。

OIR模型的诱导可分为两个阶段29:在第1阶段（高氧阶段），由于VEGF下降和内皮细胞凋亡，视网膜血管发育因血管闭塞和退化而停止或延迟24，30;在第 2 阶段（缺氧阶段），在室内空气条件下视网膜氧气供应将变得不足29，这对于神经发育和体内平衡19，31 至关重要。这种缺血情况通常会导致不受调节的异常新生血管形成。

目前，常用的建模方法是交替的高/低氧暴露:母亲和它们的幼崽在P7下暴露在75%的氧气下5天，然后在室内空气中暴露5天，直到P17显示出可比的结果22，这是OIR小鼠模型诱导的终点。（图1）。除了模拟ROP，这种缺血介导的病理性新生血管也可用于研究其他缺血性视网膜疾病。该模型的主要测量包括量化VO和NV的面积，通过免疫荧光染色或FITC-葡聚糖灌注从视网膜平面安装中分析。由于致命的操作，每只老鼠只能研究一次。目前，在血管消退和病理血管生成过程中连续观察视网膜血管系统动态变化的方法很少32.在本文中，我们提供了OIR模型诱导的详细方案，视网膜平面安装的分析以及荧光素眼底血管造影（FFA）的工作流程，这将有助于更全面地了解OIR小鼠模型两个阶段的血管动力学变化。

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研究方案

所有涉及使用小鼠的程序均由中国中山大学中山眼科中心动物实验伦理委员会批准（授权编号:2020-082），并符合中山市眼科中心动物护理和使用委员会批准的指南和视觉和眼科协会（ARVO）关于动物用于眼科和视觉研究的声明。

1. 小鼠OIR模型的归纳

  1. 使用眼睛先天性畸形率较低的小鼠，例如C57BL / 6J小鼠，并以雄性/雌性= 1:2的比例交配它们。让同一天出生的幼崽在P7开始诱导OIR模型。建模前严格记录小鼠幼崽的体重。
    注意:请注意出生日期为 P0。定期记录每只鼠标的重量。新生幼崽的体重在诱导OIR期间非常重要，因为不同状态下小鼠对氧气的敏感性不同。在P7时排除超过5克的幼崽，以确保可比的结果。
  2. 为哺乳母亲及其幼崽提供适宜的生活环境，如将温度设定在23°C±2°C，将湿度控制在40%-65%，每天交替12小时光照和12h黑暗，在笼中加入一些棉絮筑巢，确保足够的消毒食物和水，并将它们放在单独通风的笼子（IVC）中。
  3. 监测腔室内的湿度和温度水平。将湿度控制在40%至65%之间，并将温度保持在23°C±2°C。
  4. 用氧传感器检查氧气供应，将氧气水平保持在75%，并将氧气流速控制在0.5-0.75 L/min。将 50 克苏打石灰放在腔室底部以吸收过量的 CO2 并保持 CO2 值低于 3%22。
  5. 每天至少监测一次哺乳母亲的行为，例如筑巢行为、咬幼崽和拒绝哺乳。淘汰母性差的哺乳母亲。
  6. 将P7幼崽（雄性和雌性）及其哺乳母亲放入氧气室中，其中氧气水平为75%，持续5天至P12。避免在模型诱导期间不必要地打开腔室。确保有额外的代孕母亲进行替代，以防哺乳母亲在高氧期间因肺损伤而死亡。
    注意:为确保实验的可比性，请将每位母亲的数量限制为6-8只幼崽。注意氧中毒的潜在问题，导致一些哺乳母亲死亡。哺乳母亲高氧肺损伤的体征包括但不限于呼吸频率波动、活动减少和喂养减少。当出现上述现象时，尽快用1%戊巴比妥钠（50mg/kg）对哺乳母亲实施安乐死。准备一些代孕母亲，例如129S1 / SvImJ进行替换，并仅在必要时使用它们。不建议常规更换哺乳母亲，因为这会导致频繁打开氧气室，导致氧气水平不稳定和母亲攻击。
  7. 将幼崽和它们的哺乳母亲带回P12的房间空气中，并连续监测所有幼崽的体重，直到P17。根据体重对幼崽进行分组，以确保每个实验组具有相似的体重分布。

2.视网膜整体支架的制备和免疫荧光染色

  1. 记录幼崽的体重。通过过量的麻醉剂（1%戊巴比妥钠50mg / kg）或CO2 吸入来牺牲幼崽。如有必要，可以使用其他安乐死方法，例如颈椎脱位和双侧开胸术。
  2. 使用弯曲的剪刀释放眼球和眼眶组织之间的连接。然后，将弯曲的镊子放入眼球的后部，夹住视神经，并迅速将眼睛从眼眶中抬出。在预冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗眼球，以去除眼球表面的头发和血液。
  3. 将清洁的眼球放入装有4%多聚甲醛（PFA）的2mL微量离心管中，并在室温下在摇床上以每分钟12-15转（rpm）的速度孵育15分钟（初始固定）。
    注意:已知多聚甲醛具有过敏性，通常有毒且细胞毒性极强。严格遵守安全说明，避免吸入和皮肤接触。
  4. 使用培养皿，将一滴1x PBS滴入中央部分，并在解剖显微镜下执行以下步骤，并将一个眼球放入该滴中。用一对镊子握住眼球，并使用1mL注射器针头小心地刺穿角膜缘处的角膜。将剪刀的尖端插入这个孔中，沿着角膜缘小心地切断角膜。小心不要割伤视网膜。
  5. 用一对镊子取下虹膜和晶状体。然后将剩余的眼罩放入4%PFA中，并在室温下以12-15rpm的速度在摇床上再次固定45分钟（二次固定）。
  6. 使用培养皿，将一滴 1x PBS 滴入中央部分。将固定眼球放入此滴中。用一对镊子握住眼球。用两个镊子轻轻分开视网膜和巩膜层。将剪刀的尖端放在视网膜和巩膜层之间，然后将巩膜切向视神经。从视网膜上剥离巩膜并获得视网膜杯。
    注意:用镊子握住视神经的后杯，然后用另一个镊子的弯曲端向下按压视神经头的巩膜，并以向前扫动的运动轻轻按摩视网膜，作为释放视网膜的替代方案。
  7. 用镊子松开径向透明质血管与周边视网膜的连接，夹住靠近视神经头的透明质血管根部，小心地切断透明质血管。
  8. 使用切断吸头的 2 mL 移液器转移视网膜杯。将视网膜杯放入48孔板中的一个孔中，并在室温下在摇床上以12-15rpm的速度用1x PBS洗涤3 x 5分钟。
  9. 将视网膜杯在1%Triton X-100（PBS中）和5%正常驴血清（PBS）的混合溶液中在4°C下孵育过夜。
    1. 或者，在室温下阻断和透化视网膜1小时作为替代方案。根据二抗的来源更换阻断血清。
  10. 如果使用异凝集素B4标记视网膜脉管系统，则将视网膜在48孔板的孔中孵育，其中0.1%正常驴血清（400μL）和异凝集素B4-594（1:400）在4°C下在摇床上以12-15rpm的速度孵育过夜。
    注意:如果用其他标记物（例如CD31）标记血管或标记其他细胞，请使用特定的一抗来标记它们。
  11. 将视网膜与1:100-1:500特异性一抗（在400μL 0.1%正常驴血清中）在4°C下以12-15rpm的速度在振荡器上孵育48小时（可选）
  12. 回到室温后，用0.1%PBST（0.1%TritonX-100在PBS中）在摇床上以12-15rpm的速度清洗视网膜3 x 20分钟。
  13. 将视网膜与1:1，000二抗（在400μL0.1%正常驴血清中）在4°C下以12-15rpm的速度孵育过夜。（可选）
    1. 或者，将视网膜与高亲和力二抗在室温下孵育1小时。
  14. 用DAPI（1:1，000）在室温下孵育视网膜20-25分钟以标记细胞核。
    注意:测试实验前步骤10-11和13-14中使用的所有抗体的最佳稀释比。
  15. 在室温下以12-15rpm的速度在摇床上用0.1%PBST洗涤视网膜3 x 30分钟。
  16. 将视网膜杯转移到干净的载玻片上，开口朝上。在距视神经头约 1-1.5 毫米的地方切开距视神经头约 1-1.5 毫米处，从外围到中枢放射状切开视网膜。
  17. 加入几滴 1x PBS 冲洗视网膜三次。使用干法纸干燥并压平视网膜。在盖玻片的中心添加一滴封片剂（见 材料表），然后停止添加，直到液滴的直径增加到盖玻片的一半。快速翻转盖玻片并将其放在展开的视网膜顶部。避免形成气泡。
  18. 拍摄视网膜平面支架的图像或存储并保护载玻片免受4°C的光照。

3. 视网膜平面支架的分析和定量

注意:对于OIR小鼠模型，研究人员经常记录P12-P25期间中央视网膜血管阻塞和周围视网膜病理新生血管形成区域。先前的研究表明，视网膜的中央缺血区域在P12处达到最大值，并从P13逐渐缩小到P17;同时，OIR小鼠的视网膜在P1722，29左右达到新生血管区域的峰值。从P17开始，新血管逐渐消退，功能性血管重新生长到缺血区域。视网膜脉管系统在P2533时基本恢复正常。

  1. 用10倍物镜通过荧光显微镜（见 材料表）拍摄视网膜平面安装的图像。首先，选择DAPI通道并将视神经头设置在视野的中心。然后，调整其他通道并专注于视网膜的浅表脉管系统。在照片软件中检查 拼贴 （请参阅 材料表）并设置需要拼接的照片数量。单击 开始实验 以捕获整个视网膜。
  2. 使用图像处理程序（参见 材料表）量化免疫荧光染色后的血管闭塞（VO）和新生血管形成（NV）面积。
    1. 首先，单击 魔棒工具 并根据亮度差异设置适当的公差，然后将光标移动到背景并单击鼠标。然后，选择 选择反转 以获得视网膜的基本轮廓。使用 套索工具 进一步勾勒出视网膜的细节。使用 直方图 功能，记录整个视网膜的像素值并将其写下来或在数据库程序中生成表格。
    2. 将视网膜图像分为四个象限。在每个象限中，使用套索工具绘制 VO 区域（图 2A-C），并使用魔棒工具选择 NV 区域（图 2D-F）。通过直方图中的像素信息，计算出VO和NV与整个视网膜的像素比，即VO或NV面积相对于整个视网膜的百分比。
      注意:还有一个开源和全自动的管道，用于使用深度学习神经网络（http://oirseg.org/）量化OIR图像中的VO和NV区域，这为研究人员提供了一种可靠且省时的方法，并统一了量化的标准34。
  3. 将像素信息记录在电子表格表中，方便后续分析。

4. 荧光素眼底血管造影（FFA）活 体 成像

注意:对于OIR小鼠，由于实验动物的死亡，FITC灌注和免疫荧光染色只能使用一次。与此相比，FFA的优点之一是观察小鼠视网膜血管在发育过程中的动态变化和体内病理状态35，36。

  1. 麻醉前称量幼崽的重量。
  2. 通过腹膜内注射0.3%戊巴比妥钠以30-50mg / kg的剂量麻醉幼崽。
    注意:对于1个月内的小鼠，请注意麻醉剂量。使用较低浓度和剂量的麻醉剂来减少麻醉引起的小鼠死亡。幼崽麻醉后，使用小加热垫保持体温。体温过低不仅影响幼崽的生理机能，还会导致结晶蛋白的变化，加速白内障的发展。
  3. 每只幼犬使用 20 μL 散瞳眼药水（0.5% 托吡卡胺 + 0.5% 盐酸去氧肾上腺素），等待 5 分钟以实现持久的瞳孔扩张（图 3A，B）。
  4. 将麻醉的幼崽带到成像设备前（见 材料表）。将幼崽放在小加热垫上，将幼崽放在稳定位置，并定期使用人工泪液来保持角膜中的水分。单击 红外眼底成像（IR） 的模式，将视神经头调整到屏幕中央。
    注意:观察幼崽的一只眼睛时，不要忘记保护另一只眼睛。使用羟丙甲纤维素滴眼液以防止角膜因干燥而变白。
  5. 腹腔注射0.15 mL 0.5%荧光素钠溶液后，立即在成像设备的触摸屏上单击 FA 按钮和 注射 按钮以开始计时。当视网膜的血液循环进入静脉期时，3分钟后记录图像，并观察视网膜不少于6-8分钟。
    注意:腹腔注射荧光素钠盐溶液后，幼崽的皮肤，粘膜和尿液呈现明显的黄绿色。大部分荧光素在一天内由幼崽排泄。每隔一天腹膜内注射荧光素钠六次不会引起明显的副作用37。
  6. 将视神经头移动到图像采集区域的中心，并拍摄中央视网膜的第一张图像。然后，将成像装置的晶状体水平移动到眼睛的鼻侧，直到视神经头位于图像采集区域一侧的中点并拍摄第二张图像。继续使用此方法分别拍摄颞视网膜，上视网膜和下视网膜的图像（图3C）。
    注意:回归阶段发生时，在12分钟内拍摄"五向"图像。由于镜头的角度调整有限，允许视神经头在下图像中的位置不会落在边线上。
  7. 保存图像并使用图像处理程序进行拼接。

5. 荧光素眼底血管造影（FFA）的图像处理

  1. 打开成像处理程序，然后单击"文件中的新建"以创建具有黑色背景的新画布（图 4A）。
  2. 首先在背景层中打开中央视网膜的图像。单击" 文件 "并添加第二张图像。将第二个图像的不透明度调整为 60%，移动第二个图像并调整其大小，直到两个图像的相同部分高度重叠。单击在 自由变换和翘曲模式之间切换 按钮，并在必要时对船只进行细微调整。然后，将第二张图像的不透明度转回 100%（图 4A，B）。
  3. 同时选择两个图像，然后单击 自动混合图层。检查 全景 作为混合方法，然后选择以下两个句子。单击 "确定" 并完成前两个图像的图像拼接（图4C，D）。
  4. 将前两个拼接图像作为一个整体，添加第三个图像，然后继续混合。重复上述方法以完成五个图像的拼接（图4E）。
  5. 使用 裁剪工具 将不同时间点的FFA图像剪切成均匀的大小，并观察正常和OIR幼崽中视网膜脉管系统从P15到P25的动态变化。

6. 统计分析

  1. 将值显示为平均值±标准差 （s.d.）。
  2. 使用学生 t 检验比较两个独立样本。使用单因子方差分析比较多组数据，并结合邓尼特检验或图基检验，这是一种常用的多元比较检验。
  3. 对于非正态分布数据，请使用曼-惠特尼 U 检验或克鲁斯卡尔瓦利斯检验。当 P < 0.05 时，考虑显著的统计学差异。

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结果

在OIR小鼠模型中，最重要和最基本的结果是VO和NV区域的量化。从P7开始在高氧环境中生活5天后，幼崽的中央视网膜显示出最大的非灌注区域。再过5 d在缺氧的刺激下，视网膜新生血管逐渐产生，荧光比周围正常血管更强烈。P17之后，病理性新生血管化的荧光信号随着视网膜的重塑而迅速消退（图5A）。通过控制幼崽的窝产仔数和出生后体重增加，OIR小鼠模型的VO和NV面积表现...

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讨论

小鼠对OIR的易感性受到许多因素的影响。不同遗传背景和品系的幼崽无法比较。在BALB/c白化小鼠中，血管迅速重新生长到VO区，新生血管簇38明显减少，这给研究带来了一些困难。在C57BL / 6小鼠中，与BALB / cJ小鼠品系39，40相比，光感受器损伤增加。不同类型的转基因小鼠41，42，

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢我们实验室和中山眼科中心眼科动物实验室的所有成员的技术援助。我们还要感谢刘春桥教授的实验支持。这项工作得到了中国国家自然科学基金（NSFC:81670872;北京市）、广东省自然科学基金（批准号:2019A1515011347）、中山市眼科中心眼科国家重点实验室高水平医院建设项目（批准号303020103;中国广东省广州市）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL sterile syringeSolarbioYA0550For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS)Transgen Biotech FG701-01For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge TubeCorningMCT-200-CFor preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well PlatesCorning3548For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slidesVariousFor preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019Adobe Inc.For image analysis
Carbon dioxide gasVariousFor sacrifice
Cover slideVariousFor preparation of retinal flat mounts
Curved forcepsWorld Precision Instruments14127For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solutionAbcamab228549For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscopeOlmpusSZ61For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodiumSigma-AldrichF6377For in vivo imaging
Fluorescent Microscope ZeissAxioImager.Z2For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting mediaSouthernBiotech 0100-01For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl MethylcelluloseMaya89161For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibodyInvitrogenI21413For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6JGemPharmatech of Jiangsu ProvinceFor OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight bladeWorld Precision Instruments503242For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forcepsWorld Precision Instruments 501978-6For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serumAbcamab7475For preparation of retinal flat mounts
O2 sensorVariousFor monitoring the level of O2
OxyCyclerBiospherixA84XOVFor OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148-1KGFor tissue fixation
Pentobarbital sodiumVariousFor anesthesia
Soda limeVariousFor absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCTHeidelbergHC00500002For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0IBMFor statistical analysis
Tansference decloring shakerKylin-BellZD-2008For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment)Corning3261-20EAFor preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettesVariousFor preparation of retinal flat mounts
Triton X-100Sigma-Aldrich SLBW6818For preparation of retinal flat mounts
TropicamideVariousFor in vivo imaging
ZEN Imaging SoftwareZEISSFor image acquisition and export

参考文献

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