高通量抗病毒检测筛查寨卡病毒复制抑制剂

摘要

在这项研究中，我们描述了用于基于雷普利康和病毒酶的检测的协议，以高通量筛选格式筛选寨卡病毒复制的抑制剂。

摘要

抗病毒药物的发现需要开发可靠的生化和细胞检测，这些检测可以以高通量筛选 （HTS） 格式进行。黄病毒非结构性（NS）蛋白被认为在内质（ER）膜上共同转化组装，形成复制复合物（RC）。NS3和NS5是RC研究最多的酶，由于它们在病毒基因组复制中的关键作用，它们构成了药物开发的主要目标。NS3 蛋白酶域，需要 NS2B 作为其共同成因，负责将未成熟的病毒聚蛋白转化为成熟的 NS 蛋白，而 NS5 RdRp 域负责 RNA 复制。在此，我们详细描述了用于基于雷普利肯的筛查和酶检测中用于测试大型复合库以抑制寨卡病毒 （ZIKV） 复制的协议。复制物是哺乳动物细胞中表达的自复制亚基因组系统，其中病毒结构基因被报告基因所取代。化合物对病毒RNA复制的抑制作用可以通过测量受体蛋白活性的减少来轻松评估。基于重新筛选的是使用BHK-21 ZIKV雷普利康细胞系表达 蕾妮拉 ·卢西费拉斯作为记者基因进行的。为了描述已识别化合物的具体目标，我们建立了体 外 荧光检测，用于重组表达的NS3蛋白酶和NS5 RdRp。病毒蛋白酶的蛋白酶的蛋白酶活性是使用氟性肽基板Bz-nKRR-AMC测量的， 而NS5 RdRp拉长活性直接通过在RNA拉长过程中SYBR Green I的荧光信号增加而检测到，使用合成生物素化自撬模板3+UTR-U30（5'-生物素-U30-ACUGGAUCGAUCUCAGU-3'）。

引言

寨卡病毒（ZIKV）是一种新兴的节肢动物传播病毒成员的弗拉维病毒属，其中包括密切相关的登革热病毒（DENV）、日本脑炎病毒（JEV）和黄热病病毒（YFV），它们^{对公众健康}构成持续威胁。2015-16年，由于与严重的神经系统疾病（如^{新生儿2、3}和⁴岁成人的吉兰-巴雷综合征）相关，在巴西出现ZIKV疫情后，引起了全球的关注。虽然感染病例数量在未来两年内有所下降，但2019年在87个国家和地区验证了ZIKV的蚊子传播，从而证明了该病毒重新成为流行病^{的可能性。}迄今为止，还没有批准的疫苗或有效药物来预防ZIKV感染。

抗病毒药物的发现需要开发可靠的细胞和生化检测，可以以高通量筛选 （HTS） 格式进行。基于雷普利肯的筛选和病毒酶为基础的检测是测试ZIKV¹抑制剂的小分子化合物的两种有价值的策略。黄病毒非结构性（NS）蛋白被认为在内质质视网膜（ER）膜上共同转化组装，形成复制复合物^（RC）6。NS3和NS5是RC研究最多的酶，由于它们在病毒基因组复制中的关键作用，它们构成了药物开发的主要目标。NS3蛋白酶域，这需要NS2B作为其共同成因，负责将未成熟的病毒聚蛋白乳化成成熟的NS蛋白，而NS5 RdRp域负责RNA复制^6。

复制物是哺乳动物细胞中表达的自复制亚基因组系统，其中病毒结构基因被报告基因所取代。化合物对病毒RNA复制的抑制作用可以通过测量报告^{蛋白活性的}减少来轻松评估。在此，我们描述了用于以 96 井板格式筛选 ZIKV 复制抑制剂的协议。基于雷普利肯的测定是使用BHK-21 ZIKV Rluc 雷利康细胞系进行的，我们最近开发了⁸个。为了描述已识别化合物的具体目标，我们建立了体 外 荧光基测定，使用荧光肽基板对NS3蛋白酶进行重组表达， Bz-nKRR-AMC，而对于NS5 RdRp，我们测量了合成生物染色自燃模板3+UTR-U30（5'-生物素-U30-阿库加高高库-3'）的拉长，使用相互扩展的染料SYBR绿色I。

ZIKV 蛋白酶 （45-96 NS2B 共因子的残留物与 NS3 蛋白酶域的残留物 1-177 由甘氨酸丰富的链接器 [G₄SG_4]）获得， 如YFV⁹所述，而聚合酶（RdRp域的276-898残留物）被克隆和表达，详见^10。这两种酶序列都来自根班克ALU33341.1。作为初级抗病毒筛查，化合物在 10 μM 下进行测试，然后以依赖剂量的方式评估那些显示活动≥ 80% 的化合物，从而产生有效/抑制 （EC₅₀ 或 IC_50）和细胞毒性 （CC_50）浓度。在具有代表性的结果中，EC₅₀ 和 CC₅₀ 值的 NITD008，一种已知的黄病毒抑制剂^11，从基于雷利康的筛选显示。在酶测定方面，显示了MMV/DNDi大流行反应盒中两种化合物的IC₅₀ 值，该库由400个具有抗菌、抗真菌和抗病毒作用的分子组成。本工作中描述的协议可以修改为筛选其他相关黄病毒的抑制剂。

研究方案

1. 卢西费拉斯活动检测

注:确保所有涉及细胞培养的程序均在经过认证的生物安全罩中进行（参见 材料表）。

1. 准备增长介质，包括杜尔贝科的修改鹰的媒体 （DMEM）， 辅以 10% FBS 和 500 μg/mL G418。
2. 在 100% DMSO 中准备 10 mM 的测试化合物库存解决方案，然后在 100% DMSO 中将它们稀释到 1 mM。
3. 培养ZIKV Rluc在生长介质中的relicon细胞在CO²加湿孵化器（见材料表）中，在37°C的75厘米₂培养瓶中，直到它们达到70-90%的汇合。
4. 丢弃介质。在烧瓶中加入5ml的试金石，5至10分钟，然后以125 x g 离心5分钟。
5. 丢弃超高分子，在 5 mL 的 DMEM 10% FBS 中重新悬浮细胞，并在血细胞计中计数 10 μL 的再悬浮细胞。
6. 将细胞调整到 2 x 10⁴ 细胞/井，在 DMEM 10% FBS 中，在 96 井细胞培养板中每井播种 100 微升细胞（参见 材料表）。
7. 在 CO₂加湿孵化器中，在 37 °C 处将板孵化 16 小时（参见 材料表）。
8. 接下来，丢弃带有多通道微管的介质，并在板中加入 100 μL/2% 的 DMEM 2% FBS。
9. 每口井加入 1 μL 的化合物，最终在检测介质中浓度为 10 μM 1% DMSO。在第一列中，仅添加 1% DMSO 作为无抑制控制，在最后一列添加 NITD008 作为正控（100% 抑制）。
10. 在 CO₂加湿孵化器中，在 37 °C 处将板孵化 48 小时（参见 材料表）。
11. 根据制造商的说明，在室温下解冻 雷尼拉 葡萄糖酶检测系统套件，准备 1 倍 蕾妮拉 葡萄糖裂解缓冲器工作解决方案和适量的 蕾妮拉 露西费拉塞试剂（检测缓冲剂 + 基板;每口油井 100 μL）。
12. 用多通道微管从细胞中丢弃超纳坦剂，每口井加入25微升1x 雷尼拉 葡萄干裂解缓冲器。
13. 在室温下孵育板15分钟，然后用多通道微管将20微升细胞解剖转移到白色不透明的96井板（见 材料表），其中含有100μL/井的 雷尼拉 ·卢西费拉斯·阿赛试剂。
14. 在发光仪或任何可以选择读取发光的设备中读取发光信号（参见 材料表）。
15. 对于每个板，计算 Z 因子值^12，如下所示:Z = 1 - （（样本的 3SD = 3SD 的控制）/+ 样本平均值 - 控制平均值+）:SD - 标准偏差。0.5 和 1.0 之间的 Z 因子表示质量良好的检测^12。
16. 要确定EC₅₀ 值的化合物，按照第1.3至1.8步的描述进行，然后将连续稀释的化合物添加到细胞中，以及负（1% DMSO）和正（NITD008 在 10 μM）控件中。重复执行两次检测。
17. 绘制每化合物浓度抑制率的平均值，并使用图形分析软件执行西格美尔拟合并获取 EC₅₀ 值。

2. 基于细胞增殖的 MTT 检测

1. 按照项目 1 步骤 1.1 到 1.8 中的描述进行。
2. 最初在 10 μM 下添加化合物，并将控制 1% DMSO 添加到细胞中。
3. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS - 137 m M NaCl）中准备 5 毫克/毫升 MTT （3-（4，5-二甲基硫醇-2-yl） -2，5-二苯基三聚氰胺溴化物溶液， 2，7 mM KCl， 10 mM Na₂HPO₄， 1，8 mM KH₂PO₄: pH 7.4） 和漩涡，直到 MTT 完全溶解。
4. 将 MTT 溶液添加到井体积的十分之一（10 μL/井）的细胞中。
5. 在 CO₂加湿孵化器（参见 材料表）中将板在 37 °C 下孵育 3-4 小时。
6. 丢弃带有多通道微管的超高纳特，并在每口井中加入 100 μL 的 DMSO （100%）。
7. 通过上下管道溶化福马赞晶体，然后在光谱光度计中读取 570 nm 的吸水性（参见 材料表）。
8. 要确定化合物的 CC₅₀ 值，按照项目 1 步骤 1.1 到 1.8 中的描述进行，然后将连续稀释的化合物添加到细胞中，一起进行负（1% DMSO）控制。重复执行两次检测。
9. 绘制每个化合物浓度抑制率的平均值，并使用图形分析软件执行硅胶拟合并获取 CC₅₀ 值。

3. NS2B-NS3 蛋白酶活动检测

1. 在冰上解冻蛋白质。
2. 将板读卡器（参见 材料表）温度设置为 37°C。
3. 准备稀释至 80 nM（5 μL/井）的蛋白质的适当量。最终蛋白质浓度为4纳米。
4. 在冰上解冻适量的 Bz-nKRR-AMC 基材（300 μM 库存溶液在检测缓冲器中稀释，10 μL/井）。
5. 在 96 井白板（见 材料表）中，在每口油井中分配 84 μL 的检测缓冲器（20 mM Tris pH 8.5、5% 甘油和 0.01% Triton X-100）。
6. 为了做出积极的控制反应，最后一根柱子的每口井都分配了1微升的丙丙丁宁，以达到1微米（库存溶液100微米在水中稀释）的最终浓度
7. 要做出负控制反应，要向第一列分配 1 μL 的 DMSO（最终浓度 1%）。
8. 要执行复合筛选，分配每个化合物的 1 μL，以实现 10 μM（1 mM 库存浓度）的最终浓度，不包括正负控制井。
9. 分配 5 μL 的蛋白酶溶液。
10. 在 4 °C 下孵育板 30 分钟。
11. 要开始反应，可分配 10 μL 的 Bz-nKRR-AMC 库存解决方案（最终浓度为 30 μM）。
12. 将激发波长设置为 380 nm，将发射到 460 nm，并在微板读取器中每 1 分钟读取荧光 30 分钟（参见 材料表）。在 37 °C 下执行整个实验。
13. 计算正负控制反应荧光的平均值。将负控制反应荧光的平均值设定为 100%， 减去正控制的平均值，并计算每个化合物的活动百分比。
14. 对于每个板，计算 Z 因子值，如第 1.15 步所述。
15. 继续IC₅₀ 确定表现出抑制率高于80%的化合物。
16. 使用化合物的串行稀释，按照步骤 3.1-3.13 中的三重说明进行检测。
17. 绘制每个化合物浓度抑制率的平均值，并使用图形分析软件执行硅胶拟合并获取 IC₅₀ 值。

4. NS5 RdRp 拉长检测

注:此检测中使用的所有材料均为 Rnase、Dnase 和皮罗根酶免费认证。

1. 准备检测缓冲器（50 m M Tris pH 7.0，2.5 mM MnCl₂， 0.01% 特里顿 X-100） 和 200 mM ATP 库存解决方案，处理水 0.1% 二乙基碳酸酯 （DEPC）。
2. Anneal 在 PCR 中通过在热循环器中 55 °C 孵育 5 分钟，在 55°C 下孵育水，在 PCR 中培育了 5 分钟，从而获得 5 微升的₂₀₀μM 3+UT-U 30 （5'-生物素-U 30 - ACUGAUCGAUCUCACUCAU-3'） 。
3. 解冻 NS5 RdRp、200 mM ATP 和 x10.000 SYBR Green I 的库存解决方案。
4. 将蛋白质稀释至3兆L检测缓冲器中250 nM的最终浓度。
5. 通过稀释 ATP、3'UTR-U₃₀ 和 SYBR Green I 的库存解决方案，准备基板解决方案，在 3 mL 的检测缓冲中分别将最终浓度为 1 mM、300 nM 和 1X。
6. 在 96 井 PCR 板（参见 材料表）中，在每行 1 到 11 列中加入 24.5 μL 的稀释蛋白。在剩余的油井中添加相同体积的检测缓冲。
7. 对于控制和空白反应，在列 1 和 12 中添加 0.5 μL 的 DMSO。将 DMSO 中稀释的 0.5 μL 化合物添加到最终浓度为 10 μM 1mM 库存溶液中）。
8. 用密封膜密封板，在室温下孵育15分钟。
9. 通过添加 25 μL 的基板溶液开始反应，并再次密封板。
10. 在实时 PCR 系统（参见 材料表）中以 30 °C 孵育，并监测荧光 1 小时，通过 FAM 过滤器（排放:494 nm/激发:521 nm）测量每 30s 年的荧光度。
11. 对于每个板，计算 Z 因子值，如第 1.15 步所述。
12. 继续IC₅₀ 确定具有抑制率高于80%的化合物，如第3.15步所述。
13. 绘制每个化合物浓度抑制率的平均值，并使用图形分析软件执行硅胶拟合并获取 IC₅₀ 值。

结果

此处描述的所有协议均稳定在 96 井板中，并允许对每板 80 种化合物进行评估，对单个浓度进行初步筛选，包括分别放置在板第一列和最后一列的负值和正控件。基于复述的筛选在图1中表示，其中包括为获得BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo细胞系（图1A）而开发的RNA结构、测定示意图表示（图1B）和NITD008的剂量反应曲线（EC₅₀的0.28 μM， ...

讨论

此处描述的协议可以很容易地适应 384 或 1536 井格式的放映。对于以 HTS 格式进行的生化和/或基于细胞的筛选，每个板计算 Z 的因子值（统计参数），以确保这些检测¹²的灵敏度、可重复性和准确性。基于重新筛选的 Z 的因子值预计为 0.5 或以上，而 NS3 和 NS5 活动检测的系数值预计为 0.7 或以上。对于基于雷普利康的 HTS，我们开发了 BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo 细胞，这是一个稳定的细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3'	Dharmacon	-	100 ng
96-well cell culture plates	KASVI	K12-096
96-well PCR Microplate	KASVI	K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate	Corning	3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin)	SIGMA-Aldrich	257370	100 mg
Aprotinin from bovine lung	SIGMA-Aldrich	A1153	10 mg
ATP	JenaBioscience	NU-1010-1G	1 g
Bz-nKRR-AMC	International Peptides	-	5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet	ESCO
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA-Aldrich	D5758	25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	SIGMA-Aldrich	472301	1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	GIBCO	3760091
Fetal Bovine Serum	GIBCO	12657-029	500 mL
G418	SIGMA-Aldrich	A1720	Disulfate salt
Glycerol	SIGMA-Aldrich	G5516	1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate	SIGMA-Aldrich	203734	25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)	Invitrogen	M6494
NITD008 ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	SML2409	5 mg
qPCR system Mx3000P	Agilent
Renilla luciferase Assay System	PROMEGA	E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader	Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform	Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader	Molecular Devices
SYBR Green I	Invitrogen	S7563	500 µl
Triton X-100	SIGMA-Aldrich	X100	500 mL
Trizma base	SIGMA-Aldrich	T1503	1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X	SIGMA-Aldrich	59417-C	100 mL