视网膜器官诱导系统，用于从人类多能干细胞中提取3D视网膜组织

摘要

在这里，我们描述了一个优化的视网膜器官诱导系统，它适用于各种人类多能干细胞系，以产生具有高可重复性和效率的视网膜组织。

摘要

视网膜退行性疾病是无法逆转的失明的主要原因，没有有效的治疗。多能干细胞有可能分化成所有类型的视网膜细胞，甚至小视网膜组织，为这些疾病患者带来巨大的希望，在疾病建模和药物筛查方面也有很多机会。然而，从 hPSC 到视网膜细胞的诱导过程是复杂而耗时的。在这里，我们描述了一个优化的视网膜诱导协议，以产生具有高可重复性和效率的视网膜组织，适合各种人类多能干细胞。此协议执行时不添加视网膜酸，这有利于圆锥体光感受器的浓缩。本协议的优点是量化EB尺寸和电镀密度，显著提高视网膜诱导的效率和可重复性。使用这种方法，所有主要视网膜细胞依次出现并重新概括视网膜发育的主要步骤。它将促进下游应用，如疾病建模和细胞治疗。

引言

视网膜退行性疾病 （RD）， 如与年龄相关的黄斑变性 （AMD） 和视网膜炎色素 （RP）， 其特点是光感受细胞功能障碍和死亡， 通常导致不可逆转的视力丧失， 没有有效的方法来治愈¹.这些疾病背后的机制在很大程度上是未知的，部分原因是缺乏人类疾病模型^2。在过去的几十年里，通过干细胞技术在再生医学方面取得了重大进展。许多研究人员，包括我们自己，已经表明，人类多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导的多能干细胞（hiPSCs），可以通过各种分化方法^{3，4，5，6，7，8，9，10，}分化成所有类型的视网膜细胞^，甚至小视网膜组织^，11，在疾病建模和细胞治疗方面提供巨大的潜力12，13，14。

然而，从 hPSC 到视网膜细胞的诱导过程非常复杂且耗时，可重复性低，这需要具有丰富经验和高技能的研究人员。在复杂和动态的诱导过程中，许多因素将影响视网膜组织^15，16，17的产量。此外，不同的诱导方法往往在视网膜标记的正时和强健的表达上有很大的不同，这可能会混淆样本收集和数据解释^3。因此，需要一个直接的视网膜分化协议，从hPSC与分步指导。

在这里，根据我们发表的研究18，19，20，21，一个优化的视网膜诱导协议，以产生视网膜器官（ROs）与丰富的锥形光感受器从hPSCs描述，这不需要视网膜酸（RA）的补充。此协议侧重于生成神经视网膜和 RPE 的多步骤方法的描述。EB 形成是早期诱导阶段的重要组成部分。BB的大小和电镀密度都经过定量优化，科学地提高了视网膜组织的产量，提高了可重复性。在感应的第二部分，光学囊泡（OVs）在依从文化和ROs形式中自我组织在悬浮文化中:这部分的时间课程和效率在不同的 hPSC 行中差异很大。ROs中视网膜细胞的成熟和规范主要发生在诱导的中后期。如果不添加 RA，可以生产具有丰富圆锥体和棒子的成熟感光器。

此协议的目的是定量描述和详细说明每个步骤，让缺乏经验的研究人员重复。通过此协议，各种 hPSC 线已成功诱导到 ROs 中，具有丰富的锥体视网膜组织的丰产和高可重复性。使用此协议的 HPSC 衍生 ROs 可以回顾 体内视网膜发育的主要步骤，并长期存活，从而促进下游应用，如疾病建模、药物筛选和细胞治疗。

研究方案

1. hPSC的文化和扩展

1. HPSC 文化
   1. 将两口 6 井板的油井涂上细胞外基质（ECM、hESC 合格矩阵）。在杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM） 中准备 50 mL 的 ECM 解决方案，其中包含 8-12 μg/mL 的 ECM。在 49 mL 的 DMEM 中，加入 1 mL 解冻的 ECM 库存解决方案 （50 倍）。在 6 井板的每个井中加入 1 mL 的 ECM 解决方案。在 37 °C 和 5% CO₂的孵化器中孵育 1 小时。
   2. 根据制造商的说明准备 hPSC 维护介质 （MM）。
   3. 室温下预热 MM （RT） 30 分钟。
   4. 在37°C至30 s的水浴中孵育，从液氮罐中解冻一小瓶低温的hPSC（高PSC或hESC）（约1×10^6）。
   5. 取出小瓶，并使用75%消毒酒精喷雾剂仔细消毒。把它放进一个生物安全柜里。
   6. 将电池悬架从小瓶转移到 15 mL 管中，使用 5 mL 移液器将 5 mL 预热 MM 滴到管中。同时，轻轻摇动管子，混合 hPSC。
   7. 以 170 x g 离心管 5 分钟。小心地使用 1 mL 移液器取出大部分超高分子，并留下约 50 μL 的超高分子，以避免失去细胞。
   8. 在管子中加入 1 mL 的 MM，然后用 1 mL 移液器轻轻上下一两次，重新使用颗粒。
      注:hPSC单细胞的存活率很低。小细胞团与3-5细胞是首选，以保持hPSC生长在殖民地。
   9. 从预涂层油井（步骤 1.1.1）中取出 ECM，向每口油井添加 1.5 mL 的 MM，然后每口油井分配 0.5 mL 的电池悬浮。
   10. 轻轻摇动板，均匀地分配 hPSC，并将板放在 37 °C 和 5% CO₂的孵化器中。不要移动板至少24小时，以促进细胞依从性。
   11. 每隔一天更换 MM，当汇合达到 80% 左右时通过 hPSC。
2. hPSC 的传递
   注:维护 hPSC 中未分化状态对于进一步应用至关重要。在坚持的条件下，hPSC 生长在边界明确边界的殖民地。当 hPSC 的汇合达到 80% 左右时，细胞应该通过。
   1. 在显微镜下观察细胞。标记并机械地去除清晰可见的分化细胞（<5%），然后再通过。
   2. 准备第 1.1.1 步中描述的 ECM 涂层板。
   3. 预热 MM 和 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 没有 Ca^{2 +} 和 Mg^{2 +} 在 Rt 。
   4. 在 37 °C 的水浴中预热 0.5 m M EDTA（1x PBS）溶液。
   5. 使用真空吸气系统从培养板中取出介质，在每口井中加入 1 mL 的 1x PBS，使用 1 mL 移液器清洗细胞并重复两次。
   6. 每口井加入 1 mL 的 EDTA 溶液，在 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养培养器中分离 hPSC，5 分钟。不要超过建议的孵化时间，以避免分离到单个细胞。
   7. 取出盘子，在显微镜下检查细胞的分离情况。汇流 hPSC 松动，可以看到每个细胞边框，但细胞不能轻易通过轻轻摇动细胞板脱落。
   8. 用 1 mL 移液器取下 EDTA 溶液，并添加 1 mL 的 MM 以阻止分离。用 1 mL 移液器轻轻移液一两次 hPSC 以重新悬回细胞。无需离心机来收集细胞。
      注意:如果大多数细胞在与EDTA孵育后从板中脱落，细胞可以通过离心机收集。
   9. 从预涂层的油井（步骤 1.2.2）中取出 ECM，每口油井添加 1.5 mL 的 MM。
   10. 将 150-200 μL 的细胞团转移到每口井中。一般来说，hPSC 可以以 1:6 的比例通过。例如，6井板中的一口井中的细胞可以分配到6口新井中。
   11. 轻轻摇动板，均匀地分配 hPSC，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的孵化器中培养 hPSC，至少 24 小时，而不接触板。
   12. 每隔一天更改 MM，如第 1.1 步所述。

2. 视网膜与 hPSC 的分化

注:当菌落达到+80%的汇合（图1B）时，它们可以按照 图1A中所策划的协议被引导分化成视网膜器官。为了确保 hPSC 具有高质量和良好的产量，使用 IFC 或 QPCR 使用分子标记（如 OCT4 或 NANOG）定期评估多能性。如果分化细胞占总细胞的 5% 以上，则应丢弃 HPSC。根据制造商的说明，使用支原体检测套件检查支原体污染。仅使用无支原体 hPSC，因为支原体可以改变 hPSC 的分化能力。

1. 准备媒体和试剂
   1. 通过混合以下形式准备神经感应介质 （NIM）:500 mL 的 Dulbecco 改性鹰介质/营养混合物 F-12 （DMEM/F-12， 1:1）， 5 mL 1% N2 补充， 0.5 mL 0.1% 肝素 （2 毫克/mL 在 1x PBS）， 和 5 mL 的 1% MEM 非必需氨基酸 （NEAA）.
   2. 准备视网膜分化介质 （RDM） 包含 300 mL 的 DMEM/F-12， 200 mL 的 DMEM 基本， 10 mL 的 2% B27 补充剂， 5 mL 的 1% 抗生素抗菌剂， 和 5 mL 的 1% MEM NEAA.
      注意:NIM 和 RDM 均未进行过滤，但会执行不育测试。拿出1 mL的介质，并将其添加到35毫米的菜，并在37°C和5%CO 2的孵化器培养_3-7天。介质可存储在 4 °C 下，应在 2 周内使用，以确保组件的活动。
   3. 在 DMSO 中准备 10 m 布莱比斯塔汀 （1，000 倍）。加入 1，710 μL 的 DMSO 溶解 5 毫克 Blebbistatin，获得 10 mM 库存溶液（1，000 倍）、10 微升/管的 aliquot，并储存在 -20 °C 下。
      注意:除非另有提及，否则所有媒体和试剂应在 RT 加热 30 分钟，然后使用。
2. 胚胎体 （EB） 形成
   1. 在第 0 天（D0）启动区分。从 6 井板中取出一口 hPSC 井，该板已增长到 +80% 的汇合度。收集带有 EDTA 分离解决方案的细胞，如步骤 1.2.1 到 1.2.6 中所述。
   2. 取出 EDTA 溶液，加入含有 10 μM Blebbistatin 的 1 mL MM 以阻止细胞分离，并使用 1 mL 移液器收集细胞。细胞团的大小是影响 BB 产量的关键因素之一。大约，每团有五个细胞，最好在 D5 到 D7 上产生大小合适的 BB。
      注意:这是关键的一步。不要将细胞移液太多次，因为EB样聚合物很难从单个hPSC细胞中形成。
   3. 将细胞悬架（约 2 x 10⁶ 细胞）转移到 100 mm 超低附件 Petri 盘中，并将含有 10 μM Blebbistatin 的 9 mL MM 添加到盘中。
   4. 轻轻摇动两次盘，均匀地分配细胞，并将盘放在37°C和_5%CO2的培养皿中。
   5. 在 D1 上，细胞培养至少 24 小时后，取出盘子并在显微镜下观察。届时将自发形成大量小细胞聚集物（图1C）。
   6. 在 15 mL 管中以 3:1 的比例（9 mL 的 MM 和 3 mL 的 NIM）与 MM 和 NIM 混合 12 mL。
   7. 将细胞培养物转移到 15 mL 离心机管上，并垂直使用 10 mL 移液器，并将 10 mL 预加热的混合物添加到盘中。
   8. 以 60 x g 的速度离心管 3 分钟收集聚合物，使用 5 mL 移液器取出超高分子，并留下约 500 微升，以避免丢失细胞。
   9. 将混合物的 2 mL 添加到管中，并将悬架转移到同一盘（步骤 2.2.7）。
   10. 轻轻摇动盘，均匀地分配细胞聚集物，并将盘放回孵化器中。
   11. 在 D2 上，在 15 mL 管中以 1:1 的比例（6 mL 的 MM 和 6 mL 的 NIM）准备 12 mL 的新混合物与 MM 和 NIM 的混合体。通过重复从 2.2.5 到 2.2.10 的步骤，用新鲜制备的混合物改变细胞介质。
   12. 在 D3 上，用上文所述的 15 mL NIM 改变细胞介质。在暂停条件下培养细胞至少5天。
       注:在 D1 到 D3 期间，应每天更换介质，提供足够的营养。由于 D3，NIM 可以每隔一天更改一次。此外，BB可以分为几个菜肴，以提供丰富的营养。
3. 种子 Ebs
   注:在 D5 到 D7 上，根据 EBs 的大小选择适当的时间点，将 BB 放在 ECM 涂层的菜肴上。直径约 200 μm 的 BB 适用于视网膜分化。一般来说，6 井板中的一口 hPSC 可产生大约 300 到 1，000 个 BB。EB 产量的变化因 hPSC 线而异。
   1. 在 D4 上，为 EBs 粘附文化准备 ECM 涂层的菜肴。在每100毫米组织培养皿（表面处理）中加入5ml的ECM，并将其放在孵化器中过夜。
   2. 在 D5 上，从预涂层的菜肴中取出 ECM，并在每道菜中加入 10 mL 预加热的 NIM。
   3. 拿出含有 Ebs 的菜。在显微镜下检查 BB 的质量，并确保它们非常明亮和圆润。BB 的直径大约为 200 μm。在 15 mL 管中收集所有 BB。将 BB 从盘子转移到 15 mL 管与 5 mL 移液器。让 BB 安顿下来 5 分钟。去除大部分超高线，留下约2兆L的介质。
   4. 将 BB 分发到涂层的盘子中，其中含有 10 mL 的 NIM 滴答声，并配有 1 mL 移液器。以^每厘米2-3个EB的密度播种EB。例如，在 100 mm 的菜肴中加入约 120-180 个 BB。要大致判断 EB 编号，将一滴 EB 悬浮器放在覆盖唇上，并在显微镜下计算 EB 数。
      注:BB的电镀密度是影响视网膜诱导效率的关键因素之一。密度也可以根据每个 hPSC 线路进行调整。
   5. 轻轻摇动盘子，均匀地分发 EBS。把它们放在孵化器在37°C和5%CO_2。
      注意:不要移动菜肴至少 24 小时，以提高 EBS 的粘性。
4. 在依附条件下诱导光学囊泡 （OVs） 和视网膜色素上皮 （RPE）
   注:EB 在 ECM 涂层表面播种后，hPSC 可以开发类似 OV 的结构，这种结构在分化后最早可以观察到 D20。在此协议中，除了在介质中添加 N2 和 B27 补充剂外，不需要特定的生长因子或信号分子引导 hPSC 进入视网膜命运。
   1. 在 D8-D9 上，取出盘子，在显微镜下观察 BB。所有EB将连接和分散在菜肴上（图1D）。在每盘100毫米的盘子中加入10mL的新鲜NIM，其中含有10mL的旧介质。把它们放回孵化器里
      注意:不要删除旧媒体。
   2. 在 D12 上，使用 10 mL 移液器使用 NIM 更换介质的一半。将文化保留在孵化器中。
   3. 在 D16 上，使用真空吸气系统从盘子中取出所有 NIM。在每个菜中加入 20 mL 的 RDM。继续在 RDM 中培养，每隔一天更换一半的介质。
   4. 在D10-D30期间，在显微镜下观察细胞的形态变化，并评估视网膜分化的效率。
      注:自 D10 以来，眼场 （EF） 域在粘附 EBs 的外围区域自组织。类似OV的结构出现在D20到D25之间，逐渐从盘子中凸出，并自形成一个光学杯，它被色素RPE（图1E）包围着。OV 可以很容易地识别与明亮，折射，和厚厚的 NR 环。
5. 分离和文化 EV 和 RPE 悬浮以获得视网膜器官 （Ros）
   1. 在 D28-D35 上，大多数 OV 都出现在菜肴中。使用钨针或带 1 mL 注射器的针头机械地分离形态识别 OV 以及相邻的 RPE。文化他们在暂停。
      注:OV 和 RPE 的外观和产量在不同的 hPSC 线中差别很大。因此，分离 OV 和 RPE 的时间点是灵活的。与相邻的 RPE 的明显 OV 可以分离，然后移动到包含 RDM 的低附件培养皿。继续培养其余的细胞，直到所有的AV和RPEs被解除。
   2. 将 50-60 UV 放入每个 100 mm 低附件培养皿中，其中含有 15 mL 的 RDM，用于 ROs 的形成（图 1F）。
   3. 每 2-3 天更改 RDM，直到 D42，当 ROs 是圆形的。

3. 视网膜发育和成熟

注:在此协议中，血清是保持 ROs 生长和成熟的长期培养。

1. ROs 中的视网膜层压和规格
   1. 在 1x PBS 中准备 10 mL 的 100 mM 牛磺酸 （1，000x）。重125毫克的牛磺酸，溶解在10ml的1xPBS。用 0.22 μm 注射器过滤器过滤解决方案。阿利奎特在 500 μL/管， 并存储在 -20 °C.
   2. 准备视网膜培养介质 1 （RC1）。混合以下组件:250 mL DMEM/F-12， 175 mL 的 DMEM 基本， 50 mL 的胎儿牛血清， 10 mL 的 2% B27 补充， 5 mL 的 1% 抗生素抗肌酸， 5 mL 的 1% MEM NEAA， 0.5 mL 的 100 μM 牛磺酸， 和 5 mL 的 2 mM L-阿兰尼-L-谷氨酰胺.
   3. 准备视网膜培养基 2 （RC2） 包含 450 mL 的 DMEM/F-12， 50 mL 的胎儿牛血清， 5 mL 的 1% N2 补充剂， 5 mL 的 1% 抗生素抗菌剂， 0.5 mL 的 100 μm 牛磺酸， 5 mL 的 1% MEM NEAA， 和 5 mL 的 2 mM L-烷基-L-谷氨酰胺.
      注:RC1 和 RC2 未经过过滤，但要进行不育测试。取出1 mL的介质，将其添加到35毫米的盘子中，并在37°C和5%CO 2的孵化器中培养_3-7天，以确保使用前的不育。介质可存储在 4 °C 下，应在 2 周内使用，以确保组件的活动。所有媒体和试剂应在 RT 预热 30 分钟后才能使用。
   4. 在 D42 上，将培养介质从 RDM 切换到 RC1。
   5. 倾斜的菜肴在约30°，让ROs安定下来30s。拆下旧的 RDM，使用 10 mL 移液器留下约 1 mL 的介质，以避免失去 ROs。在每道菜中加入 15 mL 的新鲜 RC1。
   6. 轻轻摇动盘子，均匀地分发 ROS。把盘子放回孵化器里。之后每周更换两次整个介质。
   7. 在 D50-D90 期间，选择高品质的 ROS 进行长期培养，这些 RO 是圆形的，具有厚实明亮的 NR。将 30-40 ROs 放在 100 mm 低附件盘中，配以 20 mL 的 RC1，并且每周更换两次整个介质。
   8. 对于 Ros 的长期悬挂文化， 移液器 Ros 以避免使用移液器重新连接 RO- RO。每月将 RO 转移到新的文化菜肴中一次，以避免 ROs 粘附在菜肴表面。
      注:在悬挂培养条件下，ROs 是圆形的，一侧附加了明亮而厚实的 NR 环，或多或少地附着 RPE。层压神经视网膜发育和视网膜细胞亚型依次出现，视网膜结节细胞首先生成，其次是光受体细胞、阿马林细胞和双极细胞。
2. 人类光感受器成熟与浓缩的圆锥体在罗斯
   1. D90 后，将介质从 RC1 切换到 RC2，适合感光器成熟。
   2. 更改步骤 3.1.7-3.1.8 中描述的介质。
      注:在这种文化条件下，ROs 可以长期增长（图 1G），最高可达 D300 测试。ROs 中的视网膜细胞变得成熟，神经视网膜的所有细胞亚型，包括木耳胶质细胞、棒和圆锥体也获得。无需添加 RA，锥体光感受器也富含 ROs。

结果

本协议中的视网膜诱导过程模拟了人类胎儿视网膜的发展。为了启动视网膜分化，hPSC 被分离成小团块，并在悬浮中培养，以诱导 BB 的形成。在 D1 上，均匀的细胞聚合或 EB 形成 （图 1C）。文化媒介逐渐向NIM过渡。在 D5 上，EB 被镀在 ECM 涂层的文化菜肴上。细胞逐渐从EB中迁移出来（图1D）。从 D10 开始，眼场在粘附 BB 的外围区域自行组织。在 D16 上，?...

讨论

在这个多步骤视网膜诱导协议中，hPSC 被引导一步一步地获得视网膜的命运，并自行组织成包含层压 NR 和 RPE 的视网膜器官。在分化过程中，hPSC回顾了人类视网膜 发育在体内的所有主要步骤，从EF、OV和RPE，到视网膜层压，生成视网膜细胞的所有亚型，包括视网膜结节细胞、单体细胞、双极细胞、棒状和锥形光感受器，以及空间和时间顺序的摩尔胶质细胞。视网膜发育的回顾将有利于下游?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(−)-Blebbistatin	Sigma	B0560-5mg	ROCK-inhibitor
1 ml tips	Kirgen	KG1313	1 ml
10 ml pipette	Sorfa	3141001	Pipette
100 mm Tissue culture	BIOFIL	TCD000100	100 mm Petri dish
100 mm Tissue culture	Falcon	353003	100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150	Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishes	Falcon	353001	35 mm Petri dish
5 ml pipette	Sorfa	313000	Pipette
50 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011500	Centrifuge tubes
6 wells tissue culture plates	Costar	3516	Culture plates
Anti-AP2α Antibody	DSHB	3b5	Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X	Gibco	15240062	Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 Antibody	Boster	BM4446	Primary antibody
Anti-Ki67 Antibody	Abcam	ab15580	Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibody	gift from Dr. jeremy	/	Primary antibody
Anti-PAX6 Antibody	DSHB	pax6	Primary antibody
Anti-rabbit 555	Invitrogen	A31572	Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin Antibody	Millipore	ab5585	Primary antibody
Anti-Rhodopsin Antibody	Abcam	ab5417	Primary antibody
Anti-sheep 555	Invitrogen	A21436	Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 Antibody	Abclonal	A19710	Primary antibody
Anti-VSX2 Antibody	Millipore	ab9016	Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)	Gibco	12587010	Supplement
Cryotube vial	Thermo scientific-NUNC	375418	1.8 ml
DAPI	DOJINDO	D532	4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max	Sigma	D2650-100ML	Multiple suppliers
DMEM	Gibco	C11995500BT	Medium
DMEM /F12	Gibco	C11330500BT	Medium
EDTA	Invitrogen	15575-020	0.5 M PH 8.0
FBS	NATOCOR	SFBE	Serum
Filter	Millipore	SLGP033RB	0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100X	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine
Heparin	Sigma	H3149	2 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100x	Corning	354277	Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140050	MEM NEAA
mTeSR1	STEM CELL	85850	hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplement	Gibco	17502048	Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer	GNM	GNM10010	Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
Taurine	Sigma	T0625	Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment	Corning	CLS3262-20EA	Petri dish