使用患者来源类器官的中等通量药物和放射治疗筛选测定

摘要

我们描述了使用患者来源的类器官进行中等通量治疗敏感性筛选的详细方案。测试的疗法包括化疗、放疗和放化疗。三磷酸腺苷水平用作功能读数。

摘要

患者来源的类器官 （PDO） 模型允许长期扩增和维持以三维和接近天然状态生长的原代上皮细胞。当来源于切除或活检的肿瘤组织时，类器官与 体内 肿瘤形态密切相关，可用于研究体外治疗反应 。 肿瘤类器官的生物样本库反映了临床肿瘤和患者的多样性，因此在临床前和临床应用中具有很大的前景。本文提出了一种使用头颈部鳞状细胞癌和结直肠腺癌类器官进行中等通量药物筛选的方法。这种方法可以很容易地用于任何组织来源的类器官模型，包括正常和患病的类器官模型。描述了类器官 体外暴露于 化疗和放疗的方法（作为单一治疗方式或联合治疗）。通过测量三磷酸腺苷 （ATP） 水平来评估药物暴露 5 天后的细胞存活率。药物敏感性通过半数最大抑制浓度 （IC₅₀） 、曲线下面积 （AUC） 和生长速率 （GR） 指标来衡量。这些参数可以深入了解类器官培养物是否被认为对特定处理敏感或耐药。

引言

从成体干细胞建立并在三维 （3D） 细胞外基质 （ECM） 和特定生长因子混合物（也称为 HUB 类器官）中生长的类器官模型作为临床前肿瘤学筛选平台越来越受欢迎。患者来源的类器官 （PDO） 培养物可以在 1-2 周内从正常和患病的组织活检中建立，并且可以扩展至少 1-2 个月，直至无限时间跨度。冻存允许长期使用特征明确的培养物。与克隆来源的传统二维细胞系模型不同，PDO 模型在表型和遗传学上紧密再现了原始肿瘤组织，并保留了肿瘤异质性。PDO 上的中等通量药物筛选，测试各种疗法，为个性化医疗提供了一个独特的平台。

以前的研究描述了在从不同类型肿瘤建立的模型中使用类器官模型进行治疗筛选，特别是药物和放射治疗，并显示了类器官在指导临床决策方面的预测潜力 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 .本文描述了使用中等通量容量的 PDO 进行肿瘤治疗筛查的方法（图 1A）。该方案以半自动化的 384 孔板形式设置，允许对多达 8 种类器官模型、16 种化合物和多达 8 种 384 孔板进行治疗测试。除了化合物药物筛选，本文还描述了测定放疗敏感性和致敏性的方法。此外，还讨论了使用高通量机器人将药物筛选升级到全自动。重要的是，来自不同组织的类器官可能需要不同的培养基和不同的处理方式。

这里描述了一种通用的药物筛选测定方案，它可能需要根据感兴趣的类器官进行调整。讨论中包括起点和优化建议，以及有关实验设置和类器官实践的一般建议。使用头颈部鳞状细胞癌 （HNSCC） 类器官（通常具有致密形态）和结直肠癌 （CRC） 类器官（可能具有囊性或致密形态）给出了示例。请注意，本方案未涵盖原代类器官建立和扩增培养方法;对于基本的类器官技术，读者应参考其他协议（例如，¹²）。该可视化方案将提供对使用类器官模型进行中等通量药物筛选过程的见解。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

注意：在使用此协议之前，请确保遵循该机构人类研究伦理委员会的指导方针。本协议中描述的患者组织和数据的收集已按照 EUREC 指南并遵循欧洲、国家和地方法律进行。所有类器官均来自同意的患者，可以随时撤回同意。

1. 筛选前

1. 确认新建立模型的身份（例如，通过组织学和/或 DNA 测序 ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}），以排除正常细胞过度生长的可能性，并确保在肿瘤类器官培养物上进行药物筛选（参见图 2D）。
2. 利用讨论部分中给出的一般建议（参见 补充图 S1 中的示例）设计实验板设置。
3. 计算所需的类器官数量，并在第 0 天准备足够的可分裂的类器官（使用 表 1 作为参考）。
   注：根据类器官类型和模型的 GR，每个完整的 384 孔筛选板大约需要 1-2 个完整的 6 孔板。作为指导原则，6 孔板的一个完整孔包含 ±20,000 个囊性类器官或多达 50,000 个致密/葡萄状类器官。
4. 检查细胞分配器是否使用报告染料校准，并根据需要根据制造商的方案进行校准。

2. 试剂制备

1. 准备基础培养基：高级 DMEM/F12+++ （aDF+++）。将 1x L-谷氨酰胺替代品 （v/v）、1 M 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES） 和 100 U/mL 青霉素/链霉素各加入 500 mL 高级 DMEM/F12 瓶中。将 aDF+++ 在 4 °C 下保存长达 1 个月。
2. 为正在使用的类器官类型准备适当的类器官扩增（即生长）培养基 ^9,10。
3. 准备筛选培养基，根据实验设置，筛选培养基可能与扩增培养基不同。为了帮助在分配类器官后恢复，向筛选培养基中加入 5 μM Rho 激酶 （ROCK） 抑制剂 （Y-27632）。
4. 在 aDF+++ 中制备 100 mg/mL 的分散酶 II 溶液。
   注：分散酶的 100x 溶液在 -20 °C 下可稳定保存 2 个月。

3. 第 0 天：类器官的制备

注：下面指示的体积从完整的生长良好的 6 孔类器官板开始，相当于 1200 μL 类器官/ECM（每孔 200 μL 类器官/ECM）。

1. 使用明场显微镜检查类器官是否存在可能的感染、密度和一般外观;在传代之前拍摄所有模型的图像以供参考。
2. 根据以下步骤传代类器官和种子。在室温下执行这些步骤以减少类器官温度波动。无论何时处理类器官悬液，都使用低吸附吸头或预先润湿的移液管和塑料制品，以防止类器官损失。
   1. 当使用较大体积的 ECM/类器官（>1200 μL ECM）时，请考虑使用分散酶进行 ECM 消化，如下所示，以帮助从 ECM 中去除类器官。
      注意：分散酶分解 ECM，但不影响类器官。
      1. 可选：向每个孔中加入 1 mg/mL 分散酶，并像往常一样在 37 °C 培养箱中孵育类器官 30 分钟，然后传代。
         注：由于分散酶不会被培养基组分灭活，因此请用至少 20 倍体积的分散酶将其洗掉（使用 aDF+++）。
   2. 将类器官收集在三个 15 mL 试管中（每管最多 400 μL ECM）。用 aDF+++ 加满 12 mL，并在 RT 下以 85 × g 离心 5 分钟。如果沉淀正确，吸出上清液。如果类器官没有明显沉淀，则以更高的速度离心（高达 450 × g;取决于类器官类型和大小）再离心 5 分钟。重悬沉淀并重复洗涤。
      注：颗粒上方的玻璃状层表明存在 ECM。使用明场显微镜检查没有类器官被困在 ECM 中（少量捕获的类器官可能是可以接受的），然后用 p1000 移液器小心地去除剩余的 ECM。如果 ECM 中存在（太多）许多类器官，请重复分散酶解离步骤，或洗涤沉淀并以更高的速度（最大 450 × g）旋转。
   3. 对于每支 15 mL 试管，将类器官沉淀重悬于 1 mL aDF+++ 中，并小心解离类器官，直到它们达到合适的大小。使用用于常规分裂的解离方法，具体取决于类型/形态（表 1）。
      1. 对于囊性和葡萄状类器官，机械地破坏它们，通过使用顶部带有 p2 吸头的 p1000 上下移液，或使用预润湿的玻璃塞巴斯德移液管将其剪切成小片段 （<100 μm），其吸头已在火焰中变窄。
         注意：每 5 次上下吹打后，使用明场显微镜确认类器官破坏，旨在使类器官小于或位于筛选的尺寸范围内（表 1）。
      2. 对于致密类器官，加入 1 mL 50% v/v TrypLE 溶液的 aDF+++ 溶液以重悬细胞沉淀，并在 37 °C 下孵育至少 2 分钟。 在此之后，上下剧烈摇动试管并在明场显微镜下检查。使用与上述相同的方法，用移液管机械破坏类器官，在整个过程中不断在显微镜下检查。对于 HNSCC 类器官，在 TrypLE 的 100% 溶液中孵育 5 分钟。
         注：根据培养物的类型，目标是以小细胞群（例如，CRC 类器官，>20 μm）或单个细胞（例如，HNSCC 类器官）结束。确保蛋白水解孵育不超过 15 分钟，因为这可能会影响类器官的活力。
   4. 用 10 mL 的 aDF + ++ 洗涤类器官。将类器官以 85 × g 旋转 5 分钟;如果沉淀正确，吸出上清液。或者，如果类器官难以沉淀，则离心至 450 × g 5 分钟。
   5. 在 50% 扩增培养基/50% ECM 中高密度接种类器官（允许在第 4 节中轻松从 ECM 中去除）。与常规分流相比，目标是密度大约两倍，通常会导致 1：1 的分流（参见 图 1 中的示例）。在预热的 6 孔板的 10 μL 液滴（每孔总计 200 μL）中接种类器官。
      注意：将预热的板在 37 °C 的培养箱中过夜或在 60°C 的烘箱中放置至少 1 小时，以确保 ECM 快速凝固，防止 ECM 扩散，从而确保适当的半球圆顶形成。
   6. 倒置板并将其放回 37 °C 培养箱中 30 分钟以允许
   要设置的 ECM。30-60 分钟后，轻轻地将扩增培养基（室温）添加到孔中。

4. 第 2 天（范围：第 1 - 3 天）：类器官分配

注意：根据类器官 GR，这也可能发生在第 1 天或第 3 天。在整个药物筛选过程中，类器官保持悬浮状态。为此，它们以低浓度的 ECM （5-10%） 分配，以保持类器官生长，但不发生 ECM 凝固。这允许自动分配、最佳的类器官-化合物相互作用和可重复的细胞裂解，但也限制了更换培养基的机会。

1. 计算药物筛选所需的类器官悬浮液的浓度和量。
   1. 根据所使用的细胞分液器，在计算过程中考虑死体积。
      注：当每孔分配 40 μL 类器官悬浮液时，一个 384 板需要 15.4 mL 的总体积。平均而言，每个 Multidrop 细胞分液管的死体积为 ~1 mL，使用所有喷嘴时，死体积为 8 mL。这导致整个 384 孔板的每个类器官模型总共有 23.4 mL。因此，准备 25 mL 类器官悬浮液可确保有足够的类器官用于分配以及用于可选的后续（单核苷酸多态性，SNP）分析（参见 4.4.7）。
2. 类器官采集的准备工作
   1. 要制备洗涤缓冲液，将 ROCK 抑制剂 （Y-27632） 添加到 aDF+++ 中，最终浓度为 10 μM。（±将要筛选的每种类器官培养物需要 100 mL）。
   2. 使用明场显微镜检查所有孔中的类器官，以评估传代后的类器官恢复并排除潜在的感染。通过拍摄显微图像并使用数字比例尺测量类器官来检查类器官的大小是否正确（表 1）。
      注意：如果类器官的大小不正确（太大或太小），它们将在过滤过程中丢失，并且可能没有足够的材料进行药物筛选。如果是这种情况，建议推迟药物筛查。
   3. 向每个孔中加入 1 mg/mL 分散酶，并在 37 °C 的培养箱中孵育 30-60 分钟（最长 120 分钟）以消化 ECM。在显微镜下检查 ECM 解离的进度，以查看 ECM 液滴是否漂浮。如果没有，请将孔中的内容物移液到 ECM 液滴上，当消化完成时，液滴应该很容易脱落。
3. 按照以下步骤准备用于分配到 384 孔板中的类器官。在室温下执行这些步骤（包括离心）以减少类器官温度波动。
   1. 使用 p1000 移液管从培养板中收集类器官悬浮液。
   2. 根据所需的过滤步骤（取决于类器官类型，参见 表 1），按照相应的步骤进行作。
      注：使用洗涤缓冲液进行预润湿过滤器对于防止类器官粘附在过滤器上至关重要。
      1. 当包括所有小片段和单个细胞时，进行单次过滤， 例如，对于 HNSCC 肿瘤类器官，过滤 70 μm <类器官。将收获的类器官收集在 15 mL 试管中，并用 12 mL 洗涤缓冲液洗涤两次。通过预先润湿的 70 μm 过滤器将类器官过滤到 50 mL 试管中，用 3 x 4 mL aDF+++ 清洗过滤器，然后将它们转移到 15 mL 试管中。如果体积过高，以 85 × g 离心 5 分钟，然后将沉淀在 12 mL aDF+++ 中转移到 15 mL 试管中;请转至 4.3.3。
      2. 进行双重过滤以去除碎片和大型类器官， 例如，对于 CRC 肿瘤类器官，过滤掉 >100 μm 和 <20 μm 类器官。立即通过预润湿的 100/70/40 μm 过滤器（表 1）将收获的类器官过滤到 50 mL 试管中，并用 2 x 10 mL 洗涤缓冲液洗涤过滤器。从 6 孔类器官板中每三个孔使用一个预润湿的 20 μm 过滤器。在 20 μm 过滤器上过滤 <100 μm 类器官，并用 2 x 10 mL 洗涤缓冲液洗涤过滤器。将过滤器倒置在干净的 50 mL 试管顶部，并用 3 x 4 mL aDF+++ 洗涤，从过滤器中回收类器官。将类器官悬液转移到 15 mL 试管中;如果体积为 >15 mL（因为可能需要更多的过滤器清洗），以 85 × g 离心 5 分钟，然后将 12 mL aDF+++ 中的沉淀转移到 15 mL 试管中。
         注意：被困在过滤器中的类器官可以回收以备后用（传代）;下一步使用 < 100 μm 的类器官。通过过滤器的细胞和碎片将被丢弃，被过滤器捕获的类器官（>20 μm、<100 μm）用于筛选。
   3. 以 450 × g 离心 3 分钟，然后小心吸出上清液。在 1 mL 筛选培养基中小心重悬沉淀，再加入 1-9 mL 培养基（取决于沉淀大小;目标是有 ~75-150 个类器官/10 μL），然后用预润湿的血清移液管上下吹打重悬。
      注：建议向筛选培养基中加入 5 μM ROCK 抑制剂。
   4. 用预先润湿的血清移液管 5 次上下移液彻底混合类器官悬浮液，并通过在培养皿中移液一条线并在显微镜下计数来计数 10 μL 悬浮液中的类器官数量。对于较小的类器官 （<70 μm），将 10 μL 类器官悬浮液添加到带有血细胞计数器网格的 10 腔载玻片中，并计数类器官的数量。按照制造商的说明计算类器官的数量/mL。
   5. 通过向冰冷的筛选培养基中加入 5% （v/v） ECM 来制备所需量的分液培养基（例如，对于 25 mL 的分液培养基，将 1.25 mL ECM 添加到 23.75 mL 冰冷的筛选培养基中）。仅将 ECM 添加到冰冷的培养基中，以防止 ECM 凝固。筛选多个类器官模型时，请批量准备分配培养基，以确保所有模型之间 ECM 百分比的一致性。
   6. 将所需数量的类器官（参见 表 1 的指南和注释的讨论）添加到新的 15 mL 试管中，并以 450 × g 离心 3 分钟。小心吸出，不要干扰沉淀，然后用 p200 移液管将沉淀彻底重悬于 100 μL 的筛选培养基中。确保沉淀是均匀的并完全重悬，没有任何类器官团块。随后用所需量的冰冷分配介质填充悬浮液，并从此将类器官悬浮液保持在冰上。
4. 使用细胞分配器（例如，Multidrop）将类器官分配到 384 孔板中。
   1. 设置细胞分液器，每孔分配 40 μL 细胞悬液。
      1. 主菜单 |选择 板类型 |确定 |384 标准 |还行
      2. 盒式标准管盒（右侧） |使用向上和向下箭头 （40 μL） 选择体积。
      3. 选择 Full plate （整板 ） 或 Columns （色谱柱），具体取决于板布局。
   2. 用 70% 乙醇 （EtOH） 清洗管路，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗管路;每次洗涤使用 >15 mL。在每种液体之间留出一些空气，以可视化每次洗涤的开始和结束。检查所有分配头是否都“笔直”分配，如果不是这种情况，请再次清洗。
   3. 在 设置 菜单中，选择 预分配，并设置为 60 μL ，以便在灌注后和分配之前预先分配类器官悬浮液。
   4. 用类器官悬浮液灌注分配器，同时将悬浮液保持在冰上。通过使用 p1000 移液器连续移液来重悬。小心避免在溶液中产生气泡。灌注且板就位后，按 Start（开始）分配类器官。
      注意：两个人更容易完成此步骤：一个人重新悬浮，另一个人作分配器。
   5. 如果需要，对于筛选中包含的每个类器官模型，在额外的筛选板中至少再分配 5 个孔。
      注意：这将允许在当天晚些时候读取 T=0（参见第 7 节和讨论）。如果需要，也可以手动完成这种分配。
   6. 立即盖上板上的盖子，以免污染孔。在显微镜下确认所有孔均已正确填充，以及类器官是否均匀分布在整个板中。
   7. 如果需要，铺板完成后，从管道中回收类器官悬浮液（单击 Empty），然后将剩余的类器官向下旋转。转移至 1.5 mL 试管中，快速冷冻，用于以后的 SNP 分析。
      注：如果在分液过程中空气进入管路，并且某些孔未正确填充，请手动填充孔，每孔添加 40 μL。
   8. 如果分配了多个类器官模型，请用 PBS、EtOH 和 PBS 冲洗管道，然后对每个模型重复步骤 4.4.4-4.4.8。
   9. 将板转移至 37 °C 培养箱中的 5% CO₂ 气氛中，直至准备好进行药物分配。为了消除不同板之间的空气交换差异，请避免将板堆叠在培养箱中。
   10. 尽快用 PBS 和 EtOH 清洁管路。确保空气流经系统，使管路完全干燥。

5. 第 2 天（范围：第 1 - 3 天）：使用药物分配器（例如 D300e）进行药物分配

注意：。根据研究问题，药物打印也可以在接种后一天进行。

1. 设置药物分配器
   1. 启动分液器软件，通过突出显示 Plate 1 并选择 铅笔 工具来调出板编辑器，选择用于筛选的所需板格式。
   2. 选择 板类型 并设置每个孔的额外体积（板中已有的液体（类器官悬浮液）的体积）。对于 384 孔规格，使用 40 μL/孔。
   3. 在左侧栏中，使用 + 符号添加将在屏幕中使用的每种药物溶液。
   4. 通过选择 Pencil 工具编辑每个流体。编辑药物名称、药物类别（例如，基于 DMSO 或水性（例如，水、PBS）和药物的储备液浓度。
      注：每种药物的储备浓度不要超过 10 mM。理想情况下，DMSO 溶剂的最大浓度应为 0.8%，PBS/0.3% 去污剂（例如 Tween）的最大溶剂浓度应为 3%（参见下面的标准化和讨论）。
   5. 将所有药物添加到程序中后，通过突出显示板布局上的孔并将其拖过来选择要添加药物的孔。右键单击所选孔，然后添加浓度。
      1. 设置该值以定义每种药物的所需浓度 （μM）。
      2. 对于滴定，定义每种药物所需的最高和最低浓度 （μM）、分布（对数或线性）、每个水平的重复次数（例如 3）和滴定模式。
      3. 对于靶向滴定，定义每种药物的最高和最低浓度、分布（对数或线性）、目标浓度 （μM）、目标区域（水平）、目标范围 （log）、每个水平的重复次数（例如，3）和滴定模式。
   6. 将所有药物孔标准化为适当的溶剂（例如，DMSO 或水性 + Tween-20）。对于溶解在水溶液中的药物，添加 Tween-20（原液中的终浓度为 0.3%），以确保使用 D300e 分配时药物溶液的适当表面张力（参见 5.2.6）。选择所有孔，包括那些没有药物（阴性对照）的孔，右键单击，选择 Normalization，然后选择 Normalize。选择合适的溶剂，然后选择 Normalize to highest class volume（归一化至最高类别体积 ）以归一化为所选药物的最高浓度。
      注：现在，每个井的左下角都会显示黑色三角形，以确认归一化。目标是使用的每种药物溶剂至少有 6 个（理想情况下为 >9 个）阴性对照孔。
   7. 根据培养物，选择至少 3 个孔（理想情况下为 >6），以使用已知的细胞毒性试剂（如星形孢菌素）作为阳性对照 （1-5 μM）。如果阳性对照的细胞毒性浓度未知，请选择高浓度以杀死阳性对照孔中的所有类器官。
      注：或者，可以使用 Navitoclax （20 μM） 来确保药物筛选过程中的类器官死亡。
   8. 板布局完成后，选择左上角的 Run （运行）（如果机器已打开）。保存协议以继续。
      注意：该程序现在已经计算了每种药物的分配所需体积。由于这包括移液误差，因此这是整个方案所需的确切药物量。可选：选择 Simulate （ 模拟 ） 将模拟整个方案（不添加药物）以观察方案的运行方式。在 Run 和 Simulation 模式下，都会生成一份报告，记录添加到每个孔中的药物的时间、顺序和体积。这有助于确保实验方案正确，并在进行实验之前确定所需的包埋盒的确切体积和数量。
2. 准备和打印药物
   1. 将 0.3% （v/v） Tween-20 添加到水性（例如水或 PBS）药物原液中，以确保使用 D300e 分配时药物溶液的适当表面张力。确保 Tween-20 浓度不超过 3% PBS/0.3% Tween-20 （v/v），并将 Tween-20 的最终浓度保持在 0.01% 以下。
      注意：仅在将 Tween-20 添加到药物打印机盒之前将其添加到药物储备液中，因为储备液中高浓度的 Tween-20 可能会使（基于蛋白质的）药物（例如， 基于抗体的药物）失活。溶解在 DMSO 中的药物不需要此步骤;但是，请确保每个孔中 DMSO 的最终百分比不超过 0.8-1%。
   2. 准备好 D8+ 低容量和 D4+ 高容量包埋盒。选中 Use high volume cassettes when using high volume of normalization fluid（使用大量正一化液时在程序中使用高容量包埋盒）。
   3. 运行实验方案以开始配药。
      注意：该程序将逐步运行方案并指示需要添加每种化合物的时间和数量。使用过滤嘴处理高浓度药物。请小心按照生物安全指南处理化学废物和用过的吸头。
   4. 方案完成后，使用粘性透气和透液密封件（例如，聚氨酯医用级板密封件; 材料表）覆盖板，并将板放回 37 °C，5% CO₂。
      注意：使用这些密封件可以防止“边缘效应”蒸发（参见讨论）。如果不使用密封件，请确保板的外边缘未用于药物筛选。不要将板堆叠在一起，并确保板朝向培养箱的背面，或使用未（经常）打开的培养箱以避免温度波动。
   5. 如果放疗与印刷药物联合使用，请继续阅读第 6 部分。如果没有，请将板放在培养箱中 5 天。
      注意：根据类器官类型和药物类型，某些实验可能需要 5 天以上。对于持续 >7 天的实验，在实验程序进行到一半时小心更换培养基和化合物（例如，用新鲜的筛选培养基替换 50% 的培养基），以避免阴性对照孔中的细胞大面积死亡。

6. 第 2 天（范围：第 2 - 4 天）：使用光子束辐射处理类器官

注：以下步骤描述了类器官的照射。为了评估药物化合物的放射增敏作用，在类器官暴露于化疗后 24 小时进行照射。相同的方案用于单独评估照射的效果，其中类器官在接种后 24 小时接种和照射。这可能需要一些优化，具体取决于假设和类器官培养物。以下步骤描述了使用专门生成的 6 MV 光子束照射类器官的过程（材料表）。该机器针对临床应用进行了优化，因此反映了真实的临床实践。不同的机器可能需要不同的设置，并且可能还需要优化剂量，因为有效剂量可能与所选剂量不同。

1. 从 37 °C 培养箱中取出板，然后将盖子放回密封件顶部的每个板;不要取下密封件。在此过程中，请携带 0 Gy 板，以确保对照板经受相同的条件。
2. 将类器官运输到辐照器。用温热的自来水填充塑料盒，设置照射装置，并固定在板架上以防止板漂浮。
3. 将板浸入水中，使水与板的上表面齐平。使用不允许板漂浮的设备将板固定到位（如视频所示）。离开房间，以增加的剂量（例如，1、2、4、6、8 和 10 Gy）照射板。一次只照射一个板，因为一堆板不允许辐射均匀分散。
   注意：确保选择合适的照射剂量以达到剂量 - 反应曲线。
4. 用纸巾照射后彻底擦干板，然后盖上硬盖。将板运回培养室。取下硬盖，用轻轻喷洒的 EtOH 纸巾擦拭每个板的外部。不要取下透气密封件。
5. 将板放在培养箱的背面，以避免因开门而引起的温度波动;不要堆叠板。

7. 第 2 天。可选：CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测 （CTG） 测量板 T=0（GR 分析需要）

1. 如果旨在计算 GR 指标（参见 11.3.5 和讨论），请按照步骤 9.1-10.4 测量 T=0 板中的 CTG 值。

8. 药物筛选读数前 1 天：准备

1. 计算所需的 CTG 总体积。对于 384 孔板，每孔使用 40 μL CTG（根据制造商的建议以 1：1 的比例添加 CTG）。考虑多液滴分液的死体积（每管 1 mL）。在 4 °C 下解冻 CTG 过夜，避光。
2. 测试分配器是否需要校准。

9. 第 7 天（范围：第 7 - 14 天）：药物筛选读数：CTG 检测

1. 让 CTG 达到室温。在读数之前目视检查 384 孔板的所有孔，记录是否发生任何感染。
2. 在明场显微镜下对相关孔进行成像。包括阳性对照（星形孢菌素）、阴性对照（标准化孔）和每种药物的最高浓度。
3. 根据第 4.4 节中描述的步骤清洗和灌注 Multidrop 机器。根据板设置，向每个孔中分配 40 μL CTG。使用 multidrop 分配器的板振荡器 （Shake） 摇动 5 分钟，并在室温下避光孵育 25 分钟。
   注：CTG 反应是酶促反应，因此受温度和孵育时间的影响。据推测，信号稳定 30-60 分钟;但是，对所有板使用相同的孵育时间，尤其是在计算 GR 指标时，可以提高准确性。

10. CTG 生物发光测量

1. 打开容量为 384 孔的生物发光读板器和计算机。这里使用了 Spark 读板机。
2. 打开 Spark 方法编辑器软件（参见 材料表）。选择检测板格式： COS384fb-Corning 384 flat black | 无盖 | 无湿度盒;选择需要测量的孔。
3. 在左下角菜单中，选择 检测 |Luminescence，然后拖动到板下方。类型： 衰减，第二个菜单： 无。设置积分时间 [ms]： 500。
4. 放置板，选择它，然后单击 Start（开始）运行该方法。保存导出的电子表格。

11. 数据分析

1. 计算 Z 因子 （Z'） 以评估屏幕质量。
   1. 计算负（Ctrl^neg， 例如 DMSO）和阳性（Ctrl^pos， 例如星形孢菌素）对照的平均值 （Av） 和标准差 （SD）。
   2. 计算 Z 因子 = 1 - （3 × SD[Ctnl^负] + 3 × SD[Ctrl^位置]/mean[Ctrl^负] -mean[Ctrl^位置]）。
      注：Z' 表示阳性对照和阴性对照内的变化以及阳性对照和阴性对照之间的比率空间，因此是测定¹³ 动态范围的量度。排除 Z' 低于 0.3 的药物筛选结果;建议使用 Z' > 为 0.5 的数据。平均 Z' 通常在 0.5 到 0.7 之间变化（取决于所使用的类器官模型）。为了使 Z' 提供信息，阳性对照孔中的所有类器官都应该已经死亡。
2. 通过将 Ctrl^neg 设置为 100% 并将 Ctrl^pos 设置为 0% 活力来计算每个孔的相对类器官活力。
   1. 使用此公式计算类器官活力。
      类器官活力 = 100% ×（实验孔值 - Av Ctrl^位置）/（Av Ctrl^负 - Av Ctrl^位置）
      1. 对于辐照的类器官，计算百分比值。
         类器官活力百分比 = 100% ×（x GY 的实验孔值）/（Av Ctrl^负 孔值为 0 GY）
   2. 通过将活力数据复制到 xy 表中，为每个浓度选择适当数量的重复值，在数据分析软件程序中可视化数据。
   3. 对于对数药物浓度，转换药物浓度，并将这些值复制到表格的第一列中。
   4. 要设置图形格式，请选择图形类型 （XY），选择平均值的标准误差 （SEM），然后将原点设置为左下角。
3. 确定相对 IC₅₀、曲线下面积 （AUC） 和 GR 指标。
   1. 对于非线性回归，在 Analyze （分析 ） 选项卡中，选择 Fit a curve with nonlinear regression （拟合具有非线性回归的曲线）。选择选项 log （inhibitor） vs. normalized response - variable slope 以创建杀灭曲线。
   2. 单击 “结果 ”选项卡以显示每种药物的相对 IC₅₀ 。
      注：这是在曲线底部和顶部之间给出响应的药物浓度。底部和顶部是 y 轴单位中的平台。
   3. 对于曲线下的面积 （AUC），在 Analyze 选项卡下，选择 Area Under Curve，使用预定义的设置，然后选择 OK。
   4. 单击 Results 选项卡以显示每种药物的 AUC（总面积）。
      注意：AUC 是可测量效果的综合测量，用作药物效果的累积测量。对于某些分子，例如抗体，剂量反应曲线不是 S 形的，IC₅₀ 值难以解释。在这种情况下，AUC 值可能会提供更多信息作为比较类器官系之间差异的指标。
   5. 或者，如果在第 2 天进行 CTG 测量（可选步骤 4.4.5 和第 7 节），则计算 GR 指标。使用在线 GR 计算器¹⁴ 分析 GR 指标，同时考虑整个药物筛选过程中类器官模型之间增殖速率的差异，以确保测量更具可重复性和灵敏度。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

本实验的目的是检查 HNSCC 类器官对化疗和放疗作为单一药物的敏感性。我们还通过以一周的间隔多次执行实验来测试结果的可重复性，从而产生几次生物学重复（实验 1-3）（图 2）。按照方案，在第 0 天，从 6 孔板的 6 个孔中收获 HNSCC PDO，并以酶促和机械方式剪切成单细胞（或< 70 μm 的小类器官），并以 1：2 的分流比重新接种在 80% （v/v） ECM 中?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

本文和视频介绍了如何使用 PDO 进行中等通量药物筛选。通过优化，该协议可以用于筛选来自此处描述的不同组织类型的类器官。在筛选之前确定理想的传代时间范围很重要，因为这将因单个类器官培养而异，并取决于组织类型。每孔接种的类器官的密度和大小是需要优化的重要因素，因为生长速度更快的模型需要在孔内获得更多空间，而大小差异可能会导致更多变化。?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel