使用BrdU-DNA标记结合细胞周期鉴别成像评估全球DNA双链末端切除术

摘要

在本方案中，我们展示了如何使用基于免疫荧光的方法在细胞周期的S / G2阶段可视化DNA双链末端切除。

摘要

DNA损伤反应（DDR）的研究是一个复杂而重要的领域，由于使用DDR靶向药物进行癌症治疗，这一领域变得更加重要。这些靶标是聚（ADP-核糖）聚合酶（PARPs），其启动各种形式的DNA修复。使用PARP抑制剂（PARPi）抑制这些酶，通过在乳腺癌1型（BRCA1），BRCA2或BRCA2（PALB2）的伴侣和定位剂的突变中赋予同源重组（HR）缺陷细胞的治疗脆弱性来实现合成致死性。

用PARPi处理的细胞积累DNA双链断裂（DSBs）。这些断裂由DNA末端切除机制处理，导致单链（ss）DNA的形成和随后的DNA修复。在BRCA1缺乏的情况下，通过DNA切除抑制剂（如53BP1和DYNLL1）的突变重新激活DNA切除，会导致PARPi耐药性。因此，能够监测 纤维素中的 DNA切除对于更清楚地了解DNA修复途径和开发克服PARPi耐药性的新策略至关重要。基于免疫荧光（IF）的技术允许在DNA损伤后监测整体DNA切除。该策略需要使用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）进行长脉冲基因组DNA标记。在DNA损伤和DNA末端切除术之后，产生的单链DNA在天然条件下被抗BrdU抗体特异性检测。此外，还可以使用细胞周期标记物研究DNA切除，以区分细胞周期的各个阶段。S / G2期的细胞允许研究HR内的末端切除术，而G1细胞可用于研究非同源末端连接（NHEJ）。本文描述了这种IF方法耦合到细胞周期判别的详细方案。

引言

DNA修复因子的调节是癌症治疗的一种不断发展的方法，特别是在DNA DSB修复缺陷的肿瘤环境中。抑制特定修复因子是用于使癌细胞对DNA损伤剂敏感的巧妙策略之一。数十年的研究导致鉴定出DNA修复基因的各种突变作为治疗策略选择的生物标志物¹。因此，DNA修复领域已成为药物开发的中心，以确保广泛的治疗，从而增强个性化医疗概念。

DSB通过两种主要途径进行修复:NHEJ和^HR2。NHEJ途径容易出错，快速连接两个DNA末端，几乎没有DNA末端处理，涉及蛋白激酶（DNA-PKcs），Ku70 / 80复合物，53BP1和RIF1蛋白³。相比之下，HR是由^BRCA14发起的忠实机制。HR修复的一个重要步骤是DNA末端切除过程，该过程是断裂末端的降解，导致具有3'-OH末端的单链（ss）DNA。BRCA1 促进下游蛋白的募集，这些蛋白形成分离体 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1，这些蛋白参与 5' 至 3' DNA 切除⁵。

初始末端切除是通过MRE11的内切酶活性完成的，允许DNA2和EXO1核酸酶进一步处理。生成的ssDNA悬垂被复制蛋白A（RPA）快速包被，以保护它们免受进一步处理。随后，BRCA2，PALB2和BRCA1接合以介导RPA的位移和同源定向修复机制所需的RAD51核纤维的组装。NHEJ和HR的使用之间的良好平衡对于基因组完整性的最佳维护是必要的。通路的选择取决于细胞周期阶段。HR优先用于S至G2阶段，其中DNA切除处于最高水平，并且姐妹染色单体可用于确保适当的修复。

聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）是最早招募到DSB的蛋白质之一。它调节切除活性和^NHEJ5，6中涉及的下游效应器的组装。在复制过程中，DNA单链断裂修复也需要PARP-17^，8。由于其在DNA修复中的重要作用，PARP抑制剂（PARPi）被用作癌症疗法。在几种HR缺陷癌症中，PARPi治疗导致合成致死反应，因为HR缺陷细胞无法通过替代途径修复累积的损伤^9，10。目前有四种FDA批准的PARPi:Olaparib，Rucaparib，Niriparib和Talazoparib（也称为BMN 673），用于各种乳腺癌和卵巢癌治疗¹¹。然而，PARPi 耐药性很常见，一个潜在的原因就是通过重新获得 HR 熟练度¹² 而产生的。在存在辐照的情况下，PARP-1的丢失或抑制会使切除体机制失调，导致更长的ssDNA束积累¹³。因此，深入研究体内DNA切除对于更清楚地了解DNA修复途径以及随后开发治疗癌症和克服PARPi耐药性的新策略至关重要。

已经有几种方法用于检测DNA切除事件⁵。其中一种方法是基于IF的经典技术，允许使用抗RPA抗体在应激诱导的DSB后对切除的DNA进行间接染色和可视化。用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记基因组DNA并仅检测ssDNA是对DNA切除事件的直接测量。它规避了RPA的监测，RPA涉及DNA复制等多个细胞过程。在这里描述的方法中，与BrdU一起孵育的细胞进行单个细胞周期允许BrdU掺入复制细胞DNA的一条链中。切除后，在允许仅以ssDNA形式检测BrdU的条件下进行IF染色，并使用抗BrdU抗体。这种抗体只能进入暴露的BrdU核苷酸，不会检测到那些整合到双链DNA中的核苷酸。使用荧光显微镜，切除的DNA可以以点状BrdU / ssDNA病灶的形式可视化。这些病灶的核强度可用作量化DNA损伤后切除的读数。本文逐步描述了该方法的过程，该方法可以应用于大多数哺乳动物细胞系。这种方法应该具有广泛的实用性，作为监测 纤维素中DNA末端切除的简单方法，作为概念证明。

研究方案

1. 细胞培养、处理和盖玻片制备

注意:除照射外，所有细胞接种、转染和治疗均应在无菌细胞培养罩下进行。

1. 第 1 天
   1. 在6孔板中，在每个孔中放置一个盖玻片，以根据需要满足多种条件。根据需要将约 150，000 个 HeLa 细胞用于转染或药物治疗。
      注意:如果转染，建议在接种时进行反向转染，或者可以在接种后数小时进行正向转染以允许粘附。反向转染是通过在加入细胞之前将转染混合物添加到盖玻片中来完成的;因此，转染在细胞开始粘附之前开始。相比之下，正向转染是通常在第二天粘附到表面后添加转染混合物。但是，可以在同一天执行此操作，前提是给予足够的时间让细胞粘附。
   2. 对于这种方法，使用4孔:孔1:siRNA对照（称为siCTRL）;孔2:针对PARP-1（siPARP-1）的siRNA;井3:未经处理;孔4:在照射前1小时用5μM BMN673处理细胞。
      注意:在该协议中，所有测试都是在辐照条件下进行的（见第1.3节）。
   3. 将细胞在37°C下在5%CO ₂ 加湿的培养箱中孵育过夜，尽管转染方案允许长达3天的孵育。BrdU处理前的孵育时间取决于siRNA转染效率。如果没有转染，孵育16小时足以允许粘附在盖玻片和一些细胞生长上。
      注意:培养箱条件可根据所使用的细胞系进行更改。
2. 第 2 天
   1. 在适当的培养基中以终浓度为10μM加入BrdU，并孵育16小时（一个细胞周期）。
      注意:BrdU溶液用二甲基亚砜制备;使用的储备溶液为10mM，并在-20°C下以等分试样储存。
3. 第 3 天
   1. 用总剂量为5 Gy的X射线照射照射板（根据照射器类型改变照射剂量，例如，小动物照射器与台式照射器）。请参阅 材料表 ，了解所用辐照器的品牌和型号。
   2. 将板返回培养箱，并释放细胞3小时。
   3. 在3小时的孵育期间，在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备两种缓冲液A和B以及4%多聚甲醛（PFA）。
      注意:缓冲液A和B以及蔗糖应在固定当天新鲜制备，使用新鲜的蔗糖溶液以防止污染。
      1. 按照 表1中描述的顺序（30 mL）准备缓冲液A（预提取缓冲液）。
         注意:1M蔗糖应在使用当天制备，以防止污染。
      2. 根据 表1 （30 mL）中描述的顺序制备缓冲液B（细胞骨架剥离缓冲液）。
         注意:缓冲液B必须按引用顺序制备，以防止吐温-20和脱氧胆酸钠溶液沉淀。
      3. 在化学罩下准备4%PFA，每种条件2毫升（10毫升），（表1）。

2. 预提取和固定

注意:所有预提取和固定均使用留在冰上或4°C的组织培养板中的盖玻片进行;盖玻片仅在安装的最后一步被抬起（参见讨论）。

1. 预提取
   1. 吸出培养基，用1x PBS仔细洗涤细胞两次，然后取出PBS。加入2 mL预提取缓冲液A，并立即在4°C孵育10分钟。
      注意:重要的是，缓冲液A中的孵育时间不会延长。在预提取缓冲液中长时间孵育将导致从盖玻片中分离的细胞数量增加。或者，可以在冰上进行孵育，而不是在4°C下孵育。
   2. 通过抽吸去除缓冲液 A。
      注:取出缓冲液 A 后，请勿清洗盖玻片，请继续执行下一步。
   3. 加入2mL细胞骨架剥离缓冲液B，并立即在4°C孵育10分钟。小心地吸出缓冲液B，并用1x PBS小心地洗涤细胞一次。小心地吸出 1 个 PBS。
2. 固定
   1. 通过在化学罩下加入2 mL 4%PFA来固定细胞。
      注意:PFA是有毒的，必须在化学罩下进行操作。
   2. 将细胞在室温下孵育20分钟。用1x PBS清洗盖玻片两次，并吸出多余的。
   3. 用100%冷甲醇覆盖盖玻片，并将盖玻片在-20°C孵育5分钟。用 1 个 PBS 清洗两次。
      注意:协议可以在此处暂停。盖玻片可以在4°C下储存在1x PBS中，如有必要，板可以用铝箔包裹。在继续IF方案之前，细胞不应保持超过5天。

3. 渗透

1. 用2mL含有0.5%Triton X-100的1x PBS在室温下孵育细胞15分钟。用2 mL 1x PBS清洗盖玻片三次。

4. 免疫染色

1. 阻止步骤
   1. 准备足够的新鲜封闭缓冲液（3% BSA，1x PBS）以使用每片2 mL。
      注意:准备额外的5mL封闭缓冲液以制造抗体溶液。
   2. 向每个孔中加入2mL封闭缓冲液，并在室温下孵育1小时。
2. 一抗孵育
   1. 在新鲜的封闭缓冲液中制备一抗溶液:BrdU RPN202 1:1000和增殖细胞核抗原（PCNA）1:500，每个盖玻片100μL。
      注意:为了保存抗体，可以使用较小的体积，22 x 22 mm盖玻片为75-100μL，18 x 18 mm盖玻片为50-75μL。
   2. 在每个盖玻片上，加入100μL一抗溶液。使用镊子用正方形的parafilm覆盖盖玻片，并仔细放置parafilm以免产生气泡。
   3. 用铝箔覆盖板，并将一抗在4°C下在加湿室中孵育过夜。
   4. 取出石膏板，并用2 mL无菌1x PBS清洗盖玻片三次。
3. 二抗孵育
   1. 在新鲜封闭缓冲液中制备足够的二抗溶液:抗小鼠488荧光次级A11011（用于BrdU）稀释1:800和抗兔568荧光二次A11011（用于PCNA）稀释1:800。
      注意:使用的颜色可以更改以满足实验需求。使用的具体品牌可以在 材料表中找到。
   2. 在每个盖玻片上加入100μL二抗溶液，用镊子用正方形的副胶片盖住盖玻片，并小心地放置无气泡的副胶片。
   3. 将二抗在室温下孵育1小时，并用铝箔覆盖的板。
   4. 用2 mL 1x PBS清洗盖玻片三次。
4. 核染色
   1. 准备一份2毫升的1x PBS，含有4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），终浓度为1μg/mL（1:1000）。
   2. 在每个盖玻片上加入 2 mL DAPI 溶液。将盖玻片在室温下孵育10分钟，并用铝箔覆盖的板。用 1x PBS 清洗盖玻片两次。
   3. 用1x PBS盖住盖玻片，并使用针头或细镊子从井底抬起盖玻片。通过在纸巾上轻轻敲击一个边缘，小心地吸干多余的液体。
      注:注意不要掉落载玻片或让带有贴壁细胞的平坦表面接触纸张。
   4. 使用10-20 μL中频专用安装介质将盖玻片安装在载玻片上。

5. 图像采集和分析

注:图像采集可以在几种类型的荧光显微镜上进行。使用带有63x油物镜的落射荧光显微镜;请参阅材料 表 ，了解品牌和型号。Z-stack不是必需的，尽管它们可能有用，具体取决于细胞系和线粒体染色的水平。

1. 图像分析
   1. 对于每个图像，创建多个tiff文件;合并所有平面，但保持颜色通道分开。将这些文件导入细胞探查器（The Broad Institute https://cellprofiler.org/home）并使用斑点计数管道进行分析（补充视频 1）。
   2. 上传图片（附图S1A）。
      1. 要开始创建项目，请将斑点计数管道加载到程序中，并在提供的区域中加载要分析的图像。
      2. 使用 NamesAndTypes 模块为每个图像分配一个有意义的名称，其他模块将通过该名称引用它-C01:表示BrdU通道;C02:代表PCNA频道;C03:表示 DAPI 通道。
         注意:这些标识符将取决于显微镜;文件名中应该有一个标识符来区分通道。
   3. 确定将用于识别原子核的文件并对其进行命名（根据需要更改此名称）（请参阅 补充图S1B 和 补充图S1C）。
      1. 选择介于 50 到 300 个像素单位之间的对象直径，这是原子核的可接受大小范围，但更改该值以适合图像中的原子核。
         注意:可能是50的值太大，并且阻止了较小的细胞核被识别;同样，300可能允许将大群的原子核计为1。
      2. 丢弃直径范围之外的物体，以确保仅计算符合条件的物体。
      3. 丢弃接触边框的对象，以移除可能仅部分位于字段中的单元格。
      4. 应用阈值以适合特定图像。请注意以下设置作为示例。根据阈值策略的严格程度更改阈值校正因子。其他设置包括阈值策略:全局;阈值方法:大津;两类或三类阈值:两类;阈值平滑刻度:1;阈值平滑系数:1;阈值的下限和上限:0.0 和 1.0;区分聚集物体的方法:形状;以及在聚集的对象之间绘制分界线的方法:传播。
         注意:对于每个参数，单元探查器为变量设置提供了补充定义和可用的可能性。
   4. 确定主要对象以识别焦点（附图S2A）。
      1. 使用以下设置:选择输入图像:蒙版绿色;命名要识别的主要对象:BrdUFoci;物体的典型直径:1-15;丢弃直径范围之外的物体:是;丢弃接触图像边框的物体 : 否;阈值策略:适应性;阈值方法:大津;二类或三类阈值:三类;阈值平滑刻度:1;阈值平滑系数:3;平滑过滤器的尺寸:4。
   5. 测量强度（附图S2B）。
      1. 选择要测量的图像:OrigGreen。
      2. 点击 添加其他图片。选择要测量的图像:PCNA。选择要测量的对象:原子核。
         注:这将用于测量BrdU和PCNA强度 - 将绘制的最终数据。

结果

在该协议中，基于溴脱氧尿苷（BrdU）的测定用于定量测量HeLa细胞对照射诱导的损伤的切除反应。生成的ssDNA轨迹在免疫荧光染色后被可视化为不同的病灶（图1A）。然后将确定的病灶量化并表示为细胞核中BrdU染色的总综合强度（图1B，补充图S1，补充图S2 和 补充图S3）。可以测量病灶数或平均病灶强度，尽管这可能不如总核强?...

讨论

本文描述了一种利用IF染色来测量 纤维素中DNA切除变异的方法。目前观察对DNA切除的影响的标准是通过RPA染色;然而，这是一种可能受DNA复制影响的间接方法。此前，已经描述了另一种基于BrdU掺入的DNA切除IF技术，用于对BrdU阳性和BrdU阴性细胞中产生的强度进行分类。该方法允许由于背景或线粒体染色而未进行HR的细胞被计为阳性，从而导致高BrdU强度^14，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 568 goat anti-rabbit	Molecular probes	A11011	1:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Molecular probes	A11001	1:800
Anti PARP1 (F1-23)	Homemade		1:2500
Anti PCNA (SY12-07)	Novus	NBP2-67390	1:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)	Abcam	Ab7291	1:100000
anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1:1000
Benchtop X-ray Irradiator	Cell Rad
BMN673	MedChem Express	HY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)	Sigma	B5002
BSA	Sigma	A7906
Cell profiler	Broad Institute	V 3.19	https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft	Fisher scientific	13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen Life Technology	D1306
DMEM high glucose	Fisher scientific	10063542
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fetal Bovine serum	Gibco	12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22	Fisher scientific	12 541B
Fluorescent microscope	Leica	DMI6000B	63x immersion objective
HeLa	ATCC	CCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V	VWR	51030408	37% CO2
MgCl2	BioShop Canada	MAG520.500
NaCl	BioShop Canada	SOD002.10
Needle
PBS 1x	Wisent Bio Products	311-010-CS
PFA 16%	Cedarlane Labs	15710-S(EM)
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757-100G
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen Life Technology	P-36930
RNAiMAX	Invitrogen	13778-075
siPARPi	Dharmacon		AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA control	Dharmacon		UUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium Deoxycholcate	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sucrose	BioShop Canada	SUC507.5
Tris-base	BioShop Canada	TRS001.5
Trition X-100	Millipore Sigma	T8787-250ML
Tween20	Fisher scientific	BP337500
Tweezers