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摘要

抑郁症的慢性绝望小鼠模型（CDM）包括重复的强迫游泳课程和另一个延迟的游泳阶段作为读数。它代表了诱导慢性抑郁样状态稳定至少 4 周的合适模型，可进行修正以评估亚慢性和急性治疗干预。

摘要

重度抑郁症是最常见的精神疾病之一，并导致巨大的个人痛苦和社会经济负担。尽管其重要性，但目前的药物治疗是有限的，迫切需要新的治疗方案。寻找潜在新药的一个关键因素是在适当的动物模型中评估其抗抑郁效力。几十年来，经典的Porsolt强制游泳测试一直用于此目的，以诱导和评估抑郁样状态。它包括两个短时间的强迫游泳:第一个用于诱导抑郁状态，第二个用于评估在两次游泳会话之间给予的药物的抗抑郁作用。该模型可能适合作为潜在抗抑郁药的筛查工具，但忽略了许多抗抑郁药作用的延迟发作。清洁发展机制是最近建立的，是对经典测试的修改，但存在显著差异。小鼠被迫连续游泳5天，其想法是，在人类中，抑郁症是由慢性而不是急性压力引起的。在几天（1-3周）的休息期间，动物会出现持续的行为绝望。标准的读出方法是在额外的延迟游泳过程中测量不动时间，但提出了几种替代方法，以获得对动物情绪状态的更广泛了解。可以使用多种分析工具来针对行为、分子和电生理变化。抑郁表型稳定至少 4 周，为快速但亚慢性抗抑郁药治疗策略提供了时间窗口。此外，可以使用这种方法解决抑郁样状态发展的改变。因此，CDM是更好地了解抑郁症和开发新的治疗干预措施的有用工具。

引言

情感障碍，如重性抑郁障碍，是最常见和最具挑战性的精神疾病之一，与高个人痛苦1，自杀风险增加2有关，并给社会带来相当大的社会经济负担3。尽管具有影响，但治疗选择有限，迫切需要开发新的抗抑郁干预措施，特别是由于过去几十年来精神药理学的创新危机。为了了解抑郁症的病理生理学并测试潜在的新药剂，迫切需要合理有效的动物模型4。近半个世纪以来，最初由Porsolt5描述的经典强制游泳测试（FST）被用作诱导和读出，用于筛选潜在的新型抗抑郁药。它包括在第1天强制游泳5-15分钟，随后的一次性药物应用，以及评估小鼠在第二天的另一个游泳期间在水中不动的部分。不动时间被认为代表了缺失的自然逃逸行为，并被认为与小鼠抑郁样状态的程度相关5。

经典的FST不仅在科学界受到严厉批评6，7，8 ，而且在公共媒体上也受到严厉批评8。围绕FST的大多数争议都是由于经典范式中只有1天的诱导和治疗期短。有人认为，FST代表了一种急性创伤模型，而不是一种可与人类抑郁症相媲美的状态。此外，Porsolt测试可能适合作为潜在抗抑郁药的筛查工具，但它忽略了许多抗抑郁药作用的延迟发作。

慢性绝望模型（CDM）9，10，11，12，13，14，15，源自原始的FST，代表了更适合抑郁症的动物模型。在清洁发展机制中，连续5天反复游泳压力可避免急性创伤性影响。由于未能从反复和持续的压力情况中逃脱，老鼠被认为会发展出一种无助，投降并最终绝望的状态。这种范式更类似于当前人类抑郁症发展的心理学理论，而不是在创伤后应激障碍发作时通常经历的单一急性创伤。CDM中由此产生的抑郁样状态稳定长达4周9，因此为更长的治疗期开辟了可能性，这与临床疾病相比更好，其中抗抑郁药通常需要2-4周才能显示出益处16。

然后，对抑郁样状态的评估应该是多维的。不动时间的测量（如经典的 FST）很有用，但不应用作唯一的结果参数。下面描述的各种方法应该能够根据抑郁症患者通常发现的症状绘制抑郁状态的不同维度。合适的读出评估可能包括逃逸行为（不动时间9，10，17），尾部悬架测试（TST）9，快感缺乏（经典蔗糖偏好测试（SPT）18），以动机为导向的行为（鼻子戳蔗糖偏好测试（NPSPT）10），期望/探索行为（对模糊信号的反应19;Y-maze test9），电生理学（长期可塑性的测量（长期增强，LTP;长期抑郁，LTD）20），分子评估（即时早期基因（IEG）的激活模式;进一步的应激模式21）。

从理论上讲，重复的游泳测试可用于诱导抑郁状态，而无需对不动时间进行任何评估。但是，强烈建议至少提供具有不动时间的概念验证实验系列。此外，CDM代表了一个合适的模型，通过测量诱导阶段的不动时间来评估抑郁样状态的发展。可以评估游泳前治疗的特定小鼠品系或小鼠对压力的弹性或脆弱性以及行为绝望的诱导。

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研究方案

所有实验均按照欧洲指南（EU 2010/63）和德国动物保护法（TierSchG），FELASA（www.felasa.eu/guidelines.php），国家动物福利机构GV-SOLAS（www.gv-solas.de/index.html）指南进行，用于护理和使用实验动物，并得到弗莱堡大学动物福利委员会和斯特拉斯堡动物实验协会（CREMEAS， CEEA35），以及地方当局。将年龄为10-14周（产后70-98天，PND）的C57Bl6N野生型小鼠的两性用于野生型（WT）指示的实验。作为应激弹性系，使用前脑神经元CaMKII启动子下腺苷A1 受体表达增强的转基因小鼠系9，15。实验结束后，小鼠因颈椎脱位而处死。

1. 准备工作

  1. 获得动物研究许可证，包括全面的实验计划。
  2. 到达:抵达后，在动物设施中饲养动物以进行CDM。如果动物是从外部供应商处购买的，请允许它们至少2周来适应新环境。
  3. 住房:要容纳动物，请确保笼子没有被最大数量的动物占用，以避免额外的压力。保证住房条件符合国际建议的鼠标住房（有关更多信息，请参阅22），并始终保持它们。
    注意:最重要的标准外壳条件包括每小时换气25-120次的独立通风笼，12小时光暗循环，温度尽可能稳定（至少恒定在20-24°C之间），湿度尽可能稳定（至少45%-65%），啃咬材料和庇护所存在，没有单独的外壳。
  4. 时间点:在一天中的同一时间执行所有实验。
    注:尚未进行直接评估来验证白天对CDM的影响，但大多数评估抑郁样状态的行为测试都显示根据一天中的时间而变化23，24，25，并且白天也极有可能影响CDM。
  5. 套料材料:将套料减少到最低限度。确保保持架中没有运行轮等。
    注意:丰富的环境可防止抑郁状态的诱导。
  6. 组组成:在整个实验过程中，让动物保持在同一组中。将雌性小鼠分组在一起，甚至来自不同的幼崽;将雄性小鼠与产仔的雄性动物分组在一起。由于即将到来的攻击性，特别是男性的攻击性，咬人和理发可能会成为一个问题，因此特别强调群体组成。避免单身住房，因为剥夺是一个主要的额外压力源。
  7. 动物:使用不同的小鼠品系，即使已经观察到特定的差异9，10。常用的小鼠品系是C57Bl6N.标记小鼠以进行配对统计分析（见步骤3.2.4）。
  8. 动物性别:平均使用雄性和雌性小鼠。
  9. 动物年龄:确保动物至少10周（70 PND）大。不要使用年幼的动物，因为游泳引起的疲惫。
  10. 设备:使用容量至少为2 L，直径为24-26厘米，最小高度为30厘米的透明玻璃圆筒/烧杯。其他要求包括用于检查水温的温度计，纸巾，红光加热灯/加热垫或类似的加热源，计时器，秒表，安静的环境。对游泳课程进行录像，以便离线分析和记录。确保日期和时间在磁带/文件上连续可见，并带有单个动物的识别码。存储文件以供以后分析和进一步参考。薄膜从玻璃圆筒的侧面，而不是从上面，以方便分析。

2. 感应阶段

  1. 开始之前
    1. 目视观察动物的异常情况，包括咬人或理发的迹象。如果动物表现出任何轻微的伤害，则从实验系列中排除整个笼子。确保兽医随时可用，因为受伤在实验过程中会恶化，并且会阻止继续，因为小鼠在压力的影响下变得更加具有侵略性。
    2. 在开始实验之前，获得每只动物的体重。确保经常观察到的体重减轻不超过初始体重的20%。排除体重减轻超过20%的动物，并立即对它们实施安乐死，因为假设它们遭受了高度的痛苦。
    3. 在室温（22-23°C）下将烧杯或圆筒装满水，使其距离底部至少20厘米，在水面和容器上缘之间留下至少10厘米。
  2. 性能
    1. 轻轻地将动物转移到水中。在游泳阶段，保持动物持续观察以防止溺水。从动物看不到实验者的位置观察（例如，从隔壁房间的视频观察）。
    2. 在实验开始时设置一个计时器。10分钟后，只需抓住动物的尾巴，即可将其从水中取出。用纸巾轻轻擦干，然后将其放在加热灯下或加热垫上。
    3. 一次只评估一只动物。确保动物不能看到彼此（例如，通过房间隔板将笼子与实验装置分开）。
    4. 连续5天每天进行10分钟的强制游泳训练。
  3. 整理
    1. 在五次游泳后，将动物移回家笼，并让它们休息至少2天。随后开始具体的治疗干预。

3. 抗抑郁治疗的评估

  1. 时间课程
    1. 评估CDM的急性和亚慢性治疗。根据科学问题，调整诱导阶段和读数之间的休息时间。
    2. 为了评估氯胺酮的急性和速效效力，选择清洁发展机制诱导期后的短暂休息期（几天）。应用治疗（即腹膜内注射），然后在不久之后进行评估（额外的游泳会话或不同的评估方法）。
    3. 为了评估亚慢性治疗的效果，将治疗期延长至4周（没有关于更长治疗期的数据）。例如，在诱导阶段后4周内用丙咪嗪对动物进行口服治疗，并在此后进行评估。
    4. 在治疗期结束后立即开始评估抑郁状态，例如第二天。始终为控制和实验条件选择相同的时间段。
  2. 不动时间
    1. 概念验证
      1. 要使用不动时间作为读出方法，请评估诱导阶段的每一天和测试日，以提供概念验证（见 图1）。对于进一步的实验系列，将评估减少到第1天，第5天和测试日（见 图1C）。
      2. 每个实验都录下来。允许两名训练有素的观察者对实验条件视而不见，独立执行分析。视频分析使实验者能够从不同的房间观察行为，从而最大限度地减少对测试的干扰（例如，请参阅 补充材料中的视频文件）。
    2. 条件:在游泳测试期间观察和识别三种不同的行为条件:挣扎，游泳和不动。大多数研究人员专注于不动;进一步区分挣扎和游泳很少有用，并且大大增加了分析的复杂性和持续时间。
      1. 挣扎:动物积极地试图逃离危险的情况。这包括爪子的侧面，头部朝向墙壁和所有四肢的运动。水面通常略微湍急。
      2. 游泳:动物至少移动两只后爪，并在水中移动一段距离。它积极寻找出路，但没有试图克服船只的玻璃墙。游泳不涉及将爪子举到水面以上，身体通常与圆柱体壁平行。在这种情况下，动物经常转身或转圈。
      3. 不动:动物保持静止，处于冰冻状位置，根本不移动或仅移动尾巴或前爪以保持头部高于水面。除了被动漂浮外，没有主动移动的距离，也没有观察到前爪的定向运动。
    3. 跟踪
      1. 使用离线视频录制执行评估。使用由两名独立且经验丰富的审查员进行盲法评分，并计算两个评分之间的平均值。
      2. 如果两个评分器的结果差异高于先前确定的范围，则重复评分。持续观察小鼠，因为不同的条件经常在挣扎，游泳和不动之间变化。
      3. 使用秒表测量鼠标在水中停留10分钟内在聚焦阶段（通常不动）所花费的总时间。在更改正在进行的时间测量值之前，请考虑大约一秒钟的短暂延迟（例如，如果动物在不动状态下保持20秒，并且只移动一次不到一秒钟，然后又恢复到不动状态10秒，则总不动时间为30秒）。
    4. 统计:由于个体间标准偏差相对较高（可能是由等级相关的行为从笼子转移到游泳测试引起的），标记或标记动物以执行配对（而不是不成对）的参数测试。评估正态分布，并根据具体问题，使用事后 t 检验或配对 t 检验执行方差分析 （ANOVA） 以比较不同组。使用静止时间的绝对值或归一化值执行分析。
      1. 绝对值:给出从第1天到第5天的不动时间的平均值，以及测试日±SEM的平均值（见 图1A）。比较第 1 天和第 5 天的平均值，最好使用配对 的 t 检验来验证抑郁状态的诱导。如果第 1 天和第 5 天之间存在显著差异，请将第 5 天的平均值与测试日的平均结果进行比较。确保一个实验中的典型群体规模在6到10只动物之间，并期望野生型动物的基线和诱导后不动时间之间存在显着差异。如果由于基线差异而使用绝对值，则很难将不同组与不成对的 t检验进行比较;因此，请使用规范化值。
      2. 相对/归一化值:通过归一化将不同的治疗效果与第5天的单个结果进行比较，然后将值表示为第5天的百分比（见 图1B）。
    5. 对照实验
      注意:游泳表现可能与运动有关。导致运动过度的物质可诱发假阳性结果（即不动时间减少）;以及镇静剂可以人为地增加不动时间。
      1. 在执行游泳分析之前，评估未知物质的运动变化。在单独的一组动物中使用开放现场测试（OFT）至少10分钟。
      2. 在OFT中选择与CDM相同的观察时间（10分钟），以检测被测化合物的非特异性超机车效应，这些效应可能通过测量具有高有效性的不动时间来影响CDM的读数。
      3. 在显著的超机车效应的情况下，不要评估游泳过程以评估抗抑郁效力，而是使用不同的读出方法（例如，蔗糖偏好，尾部悬架测试等）。

4. 评估抑郁样状态的发展

  1. 为了评估抑郁症的发展，评估诱导阶段的每一天，以测量不动时间。
    注意:在这种情况下，每天不动时间的轻微增加描述了弹性，而与未经治疗或野生型动物相比，更强和更早的增加代表了对压力引起的绝望的脆弱性增强。通过在游泳事件发生前对小鼠进行治疗，可以评估有关行为绝望发展的预防性干预或转基因小鼠品系。

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结果

在CDM诱导阶段的第一次游泳中，小鼠通常表现出190秒至230秒之间的平均不动时间，该时间随着每次额外的游泳而不断上升（图1A）。这种增加在前3天更为明显，并在过去2-3天内达到平台状阶段。第5天测量的不动时间在长达4周的时间内保持稳定，表明行为绝望稳定。干预的抗抑郁药效力可以通过在诱导阶段的最后一天和测试日之间治疗动物来评估。?...

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讨论

CDM模型代表了测试新干预措施的抗抑郁效力的相关和既定模型，并为分子或电生理学实验开辟了一个延长的时间窗口，以阐明抑郁症的病理生理学。特别是当与其他测试相结合以评估类似抑郁症的状态时，CDM具有很高的面貌和概念有效性。它结合了亚慢性应激和获得性无助诱导，并产生持久的抑郁样状态。它对经典抗抑郁药的单次应用不敏感，但对亚慢性应用有反应，因此模仿人类的情况。在4周...

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披露声明

所有作者均声明没有利益冲突。

致谢

这项工作由弗莱堡大学诊所，精神病学和心理治疗系以及Berta-Ottenstein临床科学家计划（SV）的内部资金资助。TS由医学研究基金会（FRM）（AJE201912009450）和斯特拉斯堡大学高级研究所（USIAS）（2020-035）以及法国国家科学研究中心（CNRS）的资助资助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Beaker, 2000 mLKimble Kimax14000-2000any vessel >2000ml and diameter of 24-26 cm possible
Digital ThermometerHanna Instruments846-4708any digital thermometer possible
Digitalwaage 200 g DipseDIPSEtp200any digital scale possible
Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cmLenovoA 908278any standard Personalcomputer possible
Logitech PTZ ProLogitech1000005246any high resolution camera possible
Stopwatch ROTILABOCarl RothL423.1any stopwatch possible
Timer ROTILABOCarl RothA802.1any timer possible

参考文献

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