一个经济实惠且高效的“自制”果 蝇 行为研究平台，以及幼虫线粒体呼吸测定的配套方案

摘要

我们为任何具有“创客文化”思维的人提供协议，通过 3D 打印许多必要的设备，开始构建一个 flylab，用于定量分析 黑腹果蝇中的无数行为参数。我们还描述了一种使用幼虫结合行为和线粒体代谢数据的高分辨率呼吸测定方案。

摘要

果蝇作为模式生物对研究人类疾病、行为和基础生物学的有用性是毋庸置疑的。虽然实用，但果蝇研究在发展中国家并不受欢迎，这可能是由于人们误导了建立实验室并对这种微小的昆虫进行相关实验是困难的，并且需要昂贵的专用设备。在这里，我们描述了如何构建一个经济实惠的飞行实验室，通过 3D 打印许多必要的设备来定量分析黑腹果蝇的无数行为参数。我们提供构建内部小瓶架、求偶竞技场、运动测定设备等的方案，用于一般果蝇维护和使用成蝇和幼虫进行行为实验。我们还提供了有关如何使用更复杂的系统（例如高分辨率氧迹仪）来测量幼虫样品中线粒体耗氧量的方案，并显示了它与线粒体替代氧化酶 （AOX） 异位表达后幼虫行为变化的关联。AOX 增加幼虫活性和线粒体泄漏呼吸，并在低温下加速发育，这与酶的产热作用一致。我们希望这些协议能够激励研究人员，尤其是来自发展中国家的研究人员，使用果蝇轻松结合行为和线粒体代谢数据，这可能会导致有关基因和/或环境条件的信息，这些信息也可能调节人类生理和疾病状态。

引言

黑腹果蝇 在 100 多年前作为一种潜在的强大模式生物被引入科学界。这种潜力已在生物和生物医学科学的多个领域得到充分验证，例如遗传学、进化、发育生物学、神经生物学以及分子和细胞生物学。因此，六项诺贝尔医学或生理学奖已授予十位 果蝇 研究人员，他们对我们理解遗传、诱变、先天免疫、昼夜节律、嗅觉和发育做出了重大贡献¹。也许更重要的是， 黑腹果蝇 并没有停止为我们提供人类生物学和疾病的新模型，因为在 PubMed 上快速搜索显示过去 600 年中使用搜索词“果蝇模型”的出版物（²，截至 2021 年 2 月）。在美国， 果蝇 是生物医学界广泛分布的模式生物，NIH 在 2015 年授予的所有 R01 研究奖项中，约有 2.2% 分配给 了果蝇 研究人员³。另一方面，在巴西，在圣保罗研究基金会 （FAPESP） 的网站上搜索当前资助的项目，该基金会是圣保罗州所有科学领域研究最重要的资助机构，显示只有 24 项赠款和奖学金，果 蝇 是研究的主要对象⁴。考虑到 FAPESP 目前资助的所有 13205 个项目（^{截至 2021} 年 2 月为 5 个），这 24 个 果蝇 项目占总项目的比例不到 0.2%，比 NIH 低近 12 倍。如果我们删除旨在从生态学和/或进化学角度研究 果蝇 的资助项目，并假设其余项目使用这种生物体作为理解人类健康和疾病生物过程的模型，则该比率将降低到令人震惊的 ~0.1%。

事实上，有必要进行适当的调查，以揭示巴西/圣保罗的果蝇研究在资助项目数量上似乎不那么重要的原因。培养果蝇并不昂贵 ^6,7,8 并且相对简单，因为与脊椎动物不同，实验不需要生物伦理委员会的许可 ^9,10。然而，巴西¹¹ 需要获得批准才能使用转基因飞行线，这增加了所有涉及转基因生物的工作所固有的官僚主义。然而，这可能不会阻止感兴趣的研究人员启动 flylab。我们推测，关于模型功能的错误信息，以及与建立 flylab 和进行有意义的实验相关的预期高成本是做出这一决定的重要因素。与大多数科学设备和用品一样，必须从北美、欧洲和/或其他地方进口到巴西进行一般苍蝇维护和行为分析的适当设备，这是一个昂贵且极其耗时的过程^12,13。

最近，随着 3D 打印机变得更加实惠，任何人都可以使用，包括发展中国家的果蝇研究人员，出现了进口专用设备的替代方案。3D 打印技术在过去 10 年中被“创客文化”的成员广泛使用，这种文化基于自给自足的理念，而不是完全依赖公司制造的产品¹⁴。这样的想法一直存在于全球的学术研究实验室中，因此 3D 打印机在许多地方成为标准实验室设备也就不足为奇了^15,16。多年来，我们一直在 3D 打印飞瓶架、配合架、攀爬装置等设备，而成本仅为品牌同类产品的一小部分。FlyPi 是打印和组装自制实验室设备成本降低的典型代表，它的制造成本不到 100.00 欧元，可用作光学和荧光显微镜，能够对遗传易处理的斑马鱼、果蝇和线虫¹⁵ 进行复杂的光和热刺激。在这里，我们为任何有兴趣成为果蝇研究人员（或扩展他/她自己现有的 flylab）以 3D 打印许多必要材料的人提供了一系列协议。通过投入时间和发展一点专业知识，读者甚至能够优化此处介绍的方案，以打印更适合他/她自己的研究需求的设备。

然而，flylab 不仅仅是一个“廉价”设备的地方，尤其是当人们打算将行为分析与潜在的代谢现象联系起来时。我们还对线粒体在果蝇行为模式调节中的作用感兴趣，因为这些细胞器负责通过多种代谢途径在大多数组织中大量产生 ATP，其产物收敛于氧化磷酸化 （OXPHOS）。分析线粒体耗氧量作为了解线粒体代谢的一种方式确实需要氧合仪，这是一种更复杂的设备，遗憾的是还不能 3D 打印。由于 OXPHOS 几乎会影响所有细胞过程，因为它依赖于细胞中发生的一系列放能氧化还原反应^17,18，基于提供给线粒体的可氧化底物的耗氧率可能有助于揭示细胞器的功能是特定行为的原因还是结果。因此，我们还在这里提供了测量幼虫样品中线粒体耗氧量的方案，因为我们意识到绝大多数已发布的方案都集中在分析成虫样品上。我们表明，由 Ciona intestinalis 替代氧化酶 （AOX） 的转基因表达诱导的线粒体呼吸变化导致冷应激下幼虫活动性增加。这很可能是由于产热作用，因为 AOX 是一种非质子泵末端氧化酶，可以绕过 OXPHOS 复合物 III 和 IV（CIII 和 CIV）的活性，而不会影响线粒体膜电位 （ΔΨm） 和 ATP 的产生 19,20,21。没有昆虫（包括果蝇）或脊椎动物天然具有 AOX 21,22,23，但它在无数模型系统 24,25,26,27,28,29 中的表达已成功显示其对一般线粒体呼吸应激病症的治疗潜力，尤其是由 CIII 和/或 CIV 引起时超载。AOX 赋予对抗霉素 A 24 和氰化物^24,25 毒性水平的抵抗力，并减轻与线粒体功能障碍相关的多种表型 24,25,30,31,32。AOX 表达改变幼虫行为和线粒体功能的事实证明了对这种酶在后生动物细胞和组织代谢和生理学中的作用进行更深入研究是合理的^33,34。

我们希望通过这篇文章，我们可以帮助提高巴西等发展中国家科学界的认识，即使用 黑腹果蝇 提供的优秀遗传工具集，结合高效且负担得起的自制行为分析工具，可以相对较快地生成有关有趣生物过程的基础研究数据，具有显着的转化影响， 支持临床研究中的未来治疗研究。发展这样的共同理想将使果仁学家、医学研究人员以及生物和生物医学科学受益匪浅。最重要的是，它将使整个社会受益，因为公共资金可以更多地应用于理解和治疗人类疾病。

我们在这里提供的用于 flylab 设备的 3D 打印协议旨在与 RepRap 3D 打印机一起使用，该打印机基于³⁵ 岁的 Prusa I3 DIY 模型。我们使用 1.75 毫米白色聚乳酸 （PLA） 长丝 （SUNLU） 作为打印原材料，使用 Tinkercad 平台³⁶ 进行模型设计，并使用 Repetier-Host 软件³⁷ 将 STL 转换为 G 代码，这是向打印机提供坐标的必要步骤。如果读者想要使用替代设备、材料和软件，则需要进一步优化协议。

研究方案

1. 3D模型设计

注意：3D 打印的工作流程有三个基本步骤：（1） 3D 建模;（2） 将模型导入切片软件;（3） 选择正确的耗材，配置打印机，最后进行打印。用于模拟小型飞行样品瓶架/托盘的基本协议如下所示;该样品架与标准样品瓶配合使用，其直径约为 2.5 cm，高度约为 9.8 cm。对于新的模型设计，Tinkercad 软件提供的工具可以根据自己的需要创建不同形状、大小和厚度的工件，从而轻松处理三维结构。对于第一次涉足 3D 打印领域的果艺爱好者来说，遵循以下协议可能仍然具有挑战性，即使包含所有细节，因此我们强烈建议熟悉该软件以获得最佳效果。

1. 在线登录 Tinkercad³⁸ （图 1A）。需要事先注册个人信息才能免费访问该平台。
2. 单击 Create a new Project 开始新设计，并在窗口右上角相应地重命名 Project。按 Enter 键被定向到项目的工作平面（图 1B）。
3. 通过用鼠标左键单击右下角的 “编辑网格 ”（ 图 1B 中的红色方块），验证工作平面是否具有 200 毫米 x 200 毫米的正确尺寸。在弹出窗口（图 1C）中，确保 “Units” 是毫米，而 “Presets” 是默认值。在 “Width” 和 “Length” 字段中输入 200.00，然后单击 Update Grid 以保存更改。
4. 验证 Snap Grid 是否设置为 1.0 mm（ 图 1B 中的红色方块）。如果不是，请单击下拉菜单并选择 1.0 毫米。
5. 在右侧的 Basic Shapes 菜单（ 图 1B 中的蓝色方块 2）下，选择一个实心框并将其拖动到工作平面的中心。
6. 使用鼠标左键单击工作平面中长方体上的任意位置，以查看其边和顶点。单击任何顶点（然后变为红色）以显示框尺寸（ 图 1D 中的红色方块）。用鼠标左键单击每个尺寸，然后键入 130 mm 的长度 （L）、130 mm 的宽度 （W） 和 40 mm 的高度 （H）。通过将长方体拖动到工作平面的中间来重新定位长方体。
7. 单击屏幕右上角的工具 Ruler （ 图 1E 中的红色方块 1）。如图 1E （红色方块 2）所示，立即单击框的左下角顶点，以设置三维笛卡尔坐标系的初始点（x = 0、y = 0、z = 0）。请注意，现在将显示所选顶点与坐标初始点之间的距离（ 图 1F 中的红色方块），其中“A”、“B”和“C”分别表示到 x、y 和 z 轴的距离（在本例中应为零）。
8. 接下来，从右侧的 Basic Shapes 菜单中选择一个空（孔）框（ 图 1B 中的蓝色方块 2）并将其拖动到工作平面上。将其尺寸设置为 30 （L） x 30 （W） x 40 （H） mm，并在空框右下角绿色箭头旁边的文本框中键入 “2.00” （2.00） 将其从工作平面升高 2 mm（ 图 1G 中的红色方块）。通过在框左下角绿色箭头旁边的文本框中键入“2.00”，将空框放置在距离 x，y 坐标初始点 2 mm 的实心框内（ 图 1H 中的红色方块;与 图 1G 比较）。
9. 在空框仍处于选中状态的情况下，按键盘上的 CtrL+D 键以部署“复制”命令并创建一个尺寸完全相同的新空框。在沿 y 轴的绿色箭头旁边的文本框中键入“34.00”，在其余两个绿色箭头旁边的文本框中键入“2.00”（ 图 1I 中的红色方块），将新的空框放置在实心框内的第一个空框旁边。
10. 重复此步骤，调整与坐标初始点的正确距离，直到整个实心框充满彼此相距 2 mm 的空框（图 1J）。
11. 通过单击鼠标的左键并拖动到整个区域来选择所有框（实心和空框）。按键盘上的 CtrL+G 键部署“组”命令，并为苍蝇瓶创建一个带有 16 个空白空间的盒子（图 1K）。这是样品瓶架的最终设计。
12. 单击 Tinkercad 窗口右上角的 导出。在显示的窗口框（图 1L）上，选择 Include 旁边的 Everything in the design 和 。STL 作为文件类型。为设计文件选择一个适当的名称，并将其保存在计算机的适当位置。

2. 3D打印

注意：在本节中，我们提供了有关如何使用在步骤 1 中创建的 STL 文件并将其转换为包含打印指令到 3D 打印机的 G 代码文件的说明。这就是切片过程，为此我们使用 Repetier-Host 软件。

1. 下载 补充文件 1 并将其保存在计算机的适当位置。这是一个 .rcp 文件，其中包含下面要使用的打印机配置。要获取有关 .rcp 文件类型的更多信息，请访问³⁹。
2. 按照³⁷ 中的说明打开 Repetier-Host 软件，该软件应该已经安装在计算机上。按键盘上的 CtrL+O 键，在协议 1 中创建的计算机上打开 STL 文件。
3. 打开后，单击设计的样品瓶架，然后按键盘上的 R 键，打开屏幕右侧的编辑菜单（图 2A 中的红色方块 1）。通过单击 Object Placement 选项卡上的 Center Object 按钮（如图 2A 中的红色方块 2 所示），将对象集中在打印台上。
4. 单击 Object Placement 选项卡旁边的 Slicer 选项卡（图 2B 中的红色方块 1），然后单击下面的 Configuration 按钮（图 2B 中的红色方块 2）。请注意，左侧将打开一个新窗口，可在其中定义打印机参数，例如速度、层厚和支架（请参阅下面的讨论中的更多详细信息）。
5. 单击 Import 按钮（ 图 2E 中的红色方块 3），从文件中选择 Supplemental File 1 ，然后按 Enter。请注意，此 .rcp 文件（在步骤 2.1 中下载）提供了我们针对此样品瓶架优化的打印机自动配置的参数。
6. 要完成打印参数的配置，请在右侧菜单上为支撑类型选择 无 （ 图 2E 中的红色方块 4），因为打印这件作品不需要支撑来防止弯曲或其他变形。在 填充密度 （ 图 2E 中的红色方块 5）中，选择 20% 以创建实体结构（在下面的讨论中查看有关这些参数的更多详细信息）。
7. 单击屏幕右上角的 Slice with CuraEngine 以运行切片程序并生成 G 代码，其中包含打印机打印工件所需的信息。请注意，在右侧菜单的 Print Preview 选项卡下（在 Slicer 选项卡旁边），将显示有关完成打印作业所需的时间和材料量的信息（ 图 2F 中的红色方块 1）。
8. 单击 “保存以供 SD 打印 ”，将 G 代码文件保存在 SD 卡中（ 图 2F 中的红色方块 2）。请注意，G 代码包含设计作品的 3D 坐标，切成层，以便打印机正常运行。
9. 将 SD 卡插入 RepRap 3D 打印机，然后按照打印机屏幕上显示的信息从 SD 卡中选择打印。
10. 选择样品瓶架的 G 代码文件。请注意，打印机将自动预热并开始打印设计的作品，这应该需要几个小时。打印作业完成后，机架（图 3A）应立即准备好使用。

3. 行为分析设备

注意：可以重复方案 1 和 2 中描述的步骤，并进行适当的调整，以打印所需的几件实验室设备。然而，我们意识到，对于 Tinkercad 的初学者用户来说，设计新作品可能具有挑战性和耗时，因此我们没有提供有关如何设计所有模型的分步协议，而是提供我们创建的几个设计模型以供下载，这些模型是 STL 文件（参见 补充文件 2-11）。

1. 下载 补充文件 2 以获取小漏斗模型（图 3B），该漏斗通常用于 flylabs，通过避免苍蝇爬上这些容器的内壁逃脱，帮助将成蝇转移到新的小瓶或瓶子中。
2. 下载 补充文件 3 以获取敲击垫支架（图 3C），它可以容纳乙烯-醋酸乙烯酯泡沫或厚棉垫，当人们将苍蝇倾倒到装有新鲜食物的新容器中时，可以敲击玻璃瓶或瓶子。
3. 下载 补充文件 4 和 补充文件 5 对于我们命名为 Stalker 的相机支架模型（图 3D）。
   注意：该设备允许将任何相机（专业、网络摄像头、手机等）放置在底座顶部，在那里可以对含有幼虫或成蝇的培养皿进行成像或录像。Stalker 允许对动物行为进行水平成像，始终与培养皿保持相同的距离，例如，如果必须在不同的日期进行记录，或者如果相机需要在两次记录之间用于其他目的，这可以避免在实验测量中引入可变性。该仪器是方便的模块化设备，在从 补充文件 4 打印底座和顶部，从 补充文件 5 打印侧面后，可以很容易地组装。底部的 1 cm² 正方形可以用永久性记号笔突出显示，有助于跟踪个体动物的行进距离。使用白色细丝打印设备（至少是底座），以便背景和动物之间有足够的对比度，以便跟踪软件识别每只苍蝇。
4. 下载 补充文件 6 用于 Fly Motel 的可打印设计（图 3E），它有 10 个求偶和交配竞技场（房间），其组织方式便于一次录制 10 对单独的交配对。请注意，Fly Motel 基于⁴⁰ 年发布的设备，其中详细解释了它在行为研究中的应用。除了 3D 打印部件外，该设备还需要 12 个螺钉 （3 x 8 毫米），用于将上部固定到下部以稳定组装的设备、一块亚克力板 （60 x 60 x 3 毫米） 和一个拉链紧固装置。由于 Fly Motel 的结构更复杂，我们还提供了一个指导视频（补充文件 7），介绍如何正确组装它，前提是所有需要的部件和螺丝刀都可用。
5. 下载 T 迷宫模型的 补充文件 8 （图 3F），该模型用于使用成年果蝇进行记忆分析。关于如何使用 T 迷宫使苍蝇将排斥性气味刺激与其向光性行为联系起来的详细说明，请参见原始出版物⁴¹。该仪器还使用两个半透明的 15 mL 锥形管，这些锥形管在任何实验室中都很常见，并连接到中心件每侧的 2 cm 宽的圆形开口上。请注意，T-Maze 的打印需要支撑（请参阅 图 2 图例中的更多详细信息）。按照上述步骤 2.1-2.6 后，为支撑类型（ 图 4E 中的红色方块）选择 “Everywhere”。
6. 下载 补充文件 9 和 补充文件 10 ，用于设计我们版本的快速迭代负向性 （RING） 测定装置的可打印部分（图 3G），用于同时对多种基因型或环境条件的成蝇进行攀爬测定，以更标准化和更高通量的方式生成结果⁴².RING 设备也是模块化的，除了 3D 打印部件外，它还需要其他可以在网上或五金店以低成本轻松购买的部件：两个 Φ8 x 300 mm 的整流轴、四个 Φ8 mm 线性轴承、橡皮筋（或绳子）、一块 240 x 60 x 20 mm 的木头作为底座， 以及 8 个木螺钉 （8 mm），用于将打印部件固定到木底座上。下载 补充文件 11 ，了解有关打印或购买所有部件后如何组装设备的说明。有关如何使用 RING 装置的详细说明，请参阅原始出版物⁴²。

4. 幼虫迁移试验

注意：我们优化了该方案，最初基于 Nichols 等人 ⁴²，以研究 AOX 表达对冷应激下果 蝇 发育的影响。根据 Saari 等人34，分别用作表达 AOX 和对照幼虫的 3xtubAOX²⁵ 和 w¹¹¹⁸ 品系在 12 °C 的标准日粮²⁴ 上^培养。我们推荐该方案来分析在任何感兴趣的环境条件下培养的任何遗传条件的幼虫样品的移动性。

1. 通过在去离子水中煮沸等量的琼脂，倒入 Φ90 X 15 mm 培养皿中，并让它们在室温下凝固，制备 2% 琼脂平板。对于每个最终体积为 20 mL 的板，使用 0.4 g 琼脂。
2. 使用一对圆头镊子或刷子从培养瓶/烧瓶的侧面小心地收集游荡的 L3 幼虫，并将个体放入装有去离子水的 Φ90 x 15 mm 培养皿中不到 10 秒，以冲洗附着在体内的食物颗粒。
3. 将单个幼虫转移到含有琼脂糖的培养皿中，等待 5 分钟让动物适应。
4. 将含有单个幼虫的培养皿放在方格纸（0.2 cm² 网格）上，并计算动物在琼脂上移动时 1 分钟内穿过的线数。每交叉一条线代表 2 mm 的距离。对同一个体重复该过程 10-15 次以获得技术重复。
5. 重复步骤 4.4，至少来自不同试管/烧瓶的 8-10 个个体，在不同时间培养，以获得同一系的生物学重复。
6. 重复步骤 4.4 和 4.5 以获取另一条飞行线（或打算分析的任意数量的线）的数据。
7. 通过将带有单个幼虫的琼脂培养皿置于立体显微镜下并计数体壁的蠕动收缩次数 1 分钟，可以使用步骤 4.4-4.6 中使用的相同个体幼虫来获取有关身体运动的额外数据。获得技术和生物学重复，以估计所分析的飞线之间的平均流动性。
8. 应用统计测试来计算这些幼虫移动参数的值在感兴趣的行中不同的概率。因为我们在这里只比较来自两行的数据，所以可以应用 Student's t 检验。

5. 使用幼虫匀浆的线粒体呼吸测定法

注：以下方案经过优化，用于测量在 12°C 下培养的 AOX 表达系3x tubAOX 和对照 w¹¹¹⁸ 的幼虫匀浆的线粒体耗氧量，但我们也建议将其用于任何遗传和环境条件的幼虫样品。我们意识到，与我们在本文中提供的所有其他协议不同，进行此类实验不应作为“自制”飞行实验室的“负担得起”目标，因为实验室必须进行大量初始投资才能获得高分辨率氧合仪。该方案将与 Oroboros Instruments 的 Oxygraph-2k （O2k） 和 DatLab 软件一起使用，因此如果读者想要使用替代设备，则需要进一步优化。

1. 打开 O2k 并在连接到氧合仪的计算机中启动 DatLab 软件。分析室内的磁棒应自动开始搅拌。从腔室中取出乙醇储存溶液。
2. 用 100% 乙醇清洗腔室至少 3 次，用超纯水清洗 3 次。
3. 在 DatLab 中，窗口 O2k Control 将自动打开。在块温度 [°C] 中，输入 12 °C（或 2-47 °C 范围内的首选温度），然后按 OK。
4. 然后，第二个窗口 Edit Experiment （编辑实验） 将自动打开。根据腔室 A 和 B 中将添加的内容，在 Sample（样品 ）字段中输入样品名称，然后按 Save（ 保存）。
5. 在每个腔室中加入 1800 μL 检测缓冲液（120 mM KCl、5 mM KH₂PO₄、3 mM Hepes、1 mM EGTA、1 mM MgCl₂、2% BSA，pH 7.4）并部分关闭它们，仍然允许与外部空气进行氧气交换。让氧浓度和氧通量信号稳定下来，在至少 10 分钟内显示最小的波动。此步骤将在实验当天使用外部空气对设备进行校准（有关实验校准的更多详细信息，请参阅下面的步骤 6.3 和 6.4）。
6. 在空气校准步骤中，使用一把镊子或小画笔从培养管/培养瓶中小心地收集 20 只适当基因型的游荡幼虫，从而开始样品制备。
7. 用去离子水或 1x PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO₄ 和 2 mM KH₂PO₄）快速彻底冲洗每个幼虫，并将它们转移到含有 500 μL 冰冷分离缓冲液（250 mM 蔗糖、5 mM Tris HCl、 2 mM EGTA，pH 7.4）
8. 用 5 次冲程将整个幼虫匀浆，然后将匀浆倒入冰上的 1.5 mL 微量离心管中。
9. 向玻璃匀浆器中加入 300 μL 分离缓冲液，用 3 次冲程进一步浸碎剩余的幼虫组织，然后将匀浆再次倒入冰上的同一微量离心管中。
10. 向玻璃匀浆器中加入 200 μL 分离缓冲液，用 2 次冲程进一步浸渍残留的幼虫组织，然后将匀浆再次倒入冰上的同一微量离心管中。
11. 轻轻倒置试管两次，混合最终匀浆 （~1 mL），并将其保持在冰上，直到处理完第二个样品。
12. 重复步骤 5.6-5.11 以获得另一种基因型的幼虫匀浆。
13. 打开氧合仪室 A 和 B，将 200 μL 每种匀浆转移到每个腔室的测定缓冲液中，此时必须正好处于 12 °C。完全关闭腔室，让氧浓度和氧通量信号稳定约 10 分钟。
14. 通过向每个腔室中加入 5 μL 2 M 丙酮酸溶液、2 M 脯氨酸溶液（腔室中的终浓度 = 每个腔室 = 5 mM）和 7.5 μL 0.4 M 苹果酸盐 （1.5 mM） 溶液来开始耗氧量测量。至少等待 5 分钟以稳定信号。请注意，此时，线粒体将被可氧化底物带电，以启动三羧酸 （TCA） 循环反应。耗氧信号的任何增加都可能是由于解偶联蛋白的功能（或由于其他解偶联现象），并且可用于计算一般的解耦呼吸（在不存在腺苷酸的情况下也称为泄漏呼吸， L_N- 有关详细信息，请参阅代表结果）。
15. 向每个腔室中加入 4 μL 0.5 M ADP （1 mM） 溶液，并等待至少 5 分钟以稳定信号。通常立即观察到耗氧信号的显著增加，代表氧化磷酸化 （OXPHOS） 呼吸。这种 OXPHOS 呼吸的绝大部分是由复合物 I （CI） 驱动的。
16. 向每个腔室中加入 2 μL 0.05 M 抗霉素 A （0.05 mM） 溶液以抑制 CIII，并放置至少 5 分钟以稳定信号。对于 w¹¹¹⁸ 对照样品，应观察到耗氧信号降低至加入丙酮酸、脯氨酸和苹果酸之前看到的基础水平。来自表达 AOX 的幼虫的线粒体呼吸将对抗霉素-A 部分耐药，因为电子现在可以被引导到 AOX。CIII 抑制后应保留约 40% 的总 OXPHOS 呼吸，这应该完全由 AOX 支持。
17. 向每个腔室中加入 4 μL 0.1 M 没食子酸丙酯 （0.2 mM） 溶液以抑制 AOX，并放置至少 15 分钟以稳定信号。表达 AOX 的幼虫样品中的耗氧量水平现在应降低到添加丙酮酸、脯氨酸和苹果酸盐之前看到的基础水平。这种减少证明观察到的抗霉素 A 耐药呼吸是由于 AOX 功能。
18. 向每个腔室中加入 1 μL 0.01 M 鱼藤酮 （0.005 mM） 以抑制 CI，并放置至少 5 分钟以稳定信号，以获得独立于线粒体呼吸的样品耗氧信号。该信号通常与添加丙酮酸、脯氨酸和苹果酸之前观察到的信号一样低。
19. 保存实验并关闭 DatLab 软件。

6. 线粒体呼吸测定数据处理

注：耗氧量值是作为确定时间段内氧通量信号的平均值获得的，并表示为样品中每 mg 总蛋白每秒消耗的 pmol O₂ 。首先根据实验温度（称为空气饱和度）和最小氧浓度（通过向测定缓冲液中加入 Na₂S₂O₄ 在每个腔室中确定）来参考这些值（见 ⁴³ 以获取制造商的指南以获得零氧校准）。这些值也通过添加到每个腔室的测定缓冲液中的幼虫匀浆中的总蛋白量进行标准化。

1. 使用 Bradford 法⁴⁴ 测定每个样品的总蛋白浓度。在 DatLab 软件上重新打开已保存的实验，按顶部菜单的 Experiment（实验），然后按 Edit（编辑）。在打开的窗口中，在“单位”部分选择 mg，然后在“数量”部分输入每个腔室中添加的 200 μL 样品中所含的蛋白质量。考虑到 2 mL 的总腔室体积，软件将自动计算浓度。按 Save 按钮。
2. 按顶部菜单中的 Graph（图形 ），然后按 Select plots（选择图）。在打开的窗口中，为两个图形（1 和 2，分别指腔室 A 和 B）选择 质量通量 。按 Ok（确定）。实验结果现在通过样品的蛋白质浓度 （pmol O₂/s/mg 总蛋白） 进行标准化。
3. 在主实验结果页面的每个图表（1 和 2）的右上角，单击 O₂ 浓度。沿 x 轴，确定在腔室中添加样品之前的时间范围，在该时间范围内，氧浓度和通量信号非常稳定。
   1. 按住计算机键盘上的 Shift 键，在选定的初始时间上单击鼠标左键，沿时间轴拖动光标以选择所需的区域，然后松开鼠标按钮。对每个图形单独执行此过程。
   2. 双击图表底部所选区域的蓝色条，然后键入 “air” 以指示这些是用于计算氧空气饱和度的所选区域。
4. 单击顶部菜单栏上的 校准 ，然后选择 A：氧气，O₂ 以校准腔室 A。在打开的窗口中，验证是否选择了 O₂ Calib （黄色）。
   1. 对于 零点校准，请单击 Copy from file（从文件复制 ）并选择之前执行的零氧校准的文件（参见制造商指南的 ⁴³）。
   2. 对于 Air calibration （空气校准），在 Select Mark （选择标记） 列中选择 air （空气）。点击 校准并复制到剪贴板.
5. 单击顶部菜单栏上的 校准 ，选择 B：氧气、O₂ 并重复步骤 6.4 以校准腔室 B。
6. 在主实验结果页面的每个图表（1 和 2）的右上角，单击 每质量的 O₂ 通量。按住键盘上的 Shift 键，用鼠标左键单击，然后沿时间轴拖动光标，选择耗氧量信号的所需稳定区域。在添加丙酮酸/脯氨酸/苹果酸和 ADP 之间选择的稳定区域代表 L_N;在 ADP 和抗霉素 A 之间，OXPHOS;在抗霉素 A 和没食子酸丙酯之间（在 CIII 抑制时），抗霉素 A 抵抗呼吸;在没食子酸丙酯和鱼藤酮之间（在 CIII+AOX 抑制下），残余呼吸;鱼藤酮后（在 CI+CIII+AOX 抑制后），残余非线粒体呼吸。双击图形底部所选区域的红色条，然后输入相应的标签。
7. 点击 标记 在顶部菜单栏上，然后点击 统计.在打开的窗口的 Show 选项卡中，取消选中除 O₂ flux per mass 之外的所有选项。在同一窗口的 Select 选项卡中，选择腔室 A 以获取第一个样品的呼吸数据。单击 Copy to clipboard 并将数据粘贴到电子表格中。重复该过程以获取腔室 B 中第二个样品的数据。
8. 在电子表格中，用残余的非线粒体呼吸（鱼藤酮添加后的数据）减去所有呼吸值。计算多个实验仿行的平均值，并根据需要绘制数据。

结果

按照协议 1 和 2 中的步骤，应该能够设计一个简单的飞行瓶架，并通过切片程序运行模型 STL 文件以生成 3D 打印机的坐标。图 3A 显示了模型设计旁边的打印单元。我们还希望第 1 步可以提供基本技能，以便使用 Tinkercad 平台中提供的基本形状为实验室创建有用的设备。但是，培养这些技能可能需要不断练习并经常咨询 Tinkercad 帮助中心^4...

讨论

此处提供的 3D 打印协议和 STL 文件旨在促进新 flylab 的设置或使用“自制”设备增加现有 果蝇 行为设施中的设备库。3D 打印策略在巴西等发展中国家可能特别有用，那里使用 果蝇 作为研究人类生物学的模式生物的研究似乎代表性不足，而且专用设备成本高昂。我们的协议提供了有关如何创建塑料框架和组装相对简单的设备的说明，例如用于记忆、求偶和攀...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer RapRep			A popular 3D-printer based on the Prusa I3 DIY mode, instructions available in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line expressing the AOX gene from C. intestinalis under the control of the constitutive α-tubulin promoter. 5 and 6 copies of this construct are present in males and females in homo/hemizigosity, respectively, one in each of the chromosomes X, 2 and 3.
Acrylic plate			60 x 60 x 3 mm
ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 20398-34-9); ≥95%; molecular weight = 427.20 g/mol; solubility in water at 50 mg/ml
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight ~ 548.63 g/mol; solubility in 95% ethanol at 50 mg/mL
Agar	Kasv	K25-611001	For bacteriologal use; powder; solidifying agent (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free (CAS number 9048-46-8);pH 7; ≥98%; solubility in water 40g/ml
Deionized water
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 67-42-5); ≥97%; molecular weight = 380.35g/mol
Ethanol 99.5%
Ethylene-vinyl acetate foam			Can be replaced with thick pieces of cotton
Graph paper			0.2 cm2 grid
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9), BioPerformance Certified; ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight =238.30g/mol
Homogenizer	Sartorius		Hand glass homogenizer (S), 1 mL; composed of a cylinder made of borosilicate glass plus plunger S; often used for simple sample preparation, e.g. crushing of tissue samples.
KCl	Amresco	0395-2	Potassium chloride (CAS number 7447-40-7); ≥99,0%; molecular weight = 74.55g/mol
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Potassium phophate monobasic (CAS number 7778-77-0); ReagentPlus; molecular weight = 136.09g/mol
Linear bearings (LM8UU)			8 mm, any brand
Malate	Sigma-Aldrich	M1000	L-(-)-Malic acid (CAS number 97-67-6); ≥95-100%; molecular weight = 134.09 g/mol), solubility in water: 100 mg/mL. A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
MgCl2	Amresco	0288-1KG	Magnesium chloride, hexahydrate (CAS number 7791-18-6); 99%-102%; molecular weight = 203.3g/mol
Microcentrifuge tubes			1.5mL; Graduated every 100µL, autoclavable
Na2HPO4	Amresco	0348-1KG	Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (CAS number 7782-85-6); 98-102%; molecular weight = 268.07 g/mol
NaCl	Honeywell	31434-1KG	Sodium chloride (CAS number 7647-14-5); ≥99,5%; molecular weight 58,44g/mol. For laboratory use only.
Oxigraph-O2k	Oroboros	10000-02	Series D-G; O2k-Core: includes O2k-Main Unit with stainless steel housing, O2k-Assembly Kit, two OroboPOS (polarographic oxygen sensors) and OroboPOS-Service Kit, DatLab software, the ISS-Integrated Suction System and the O2k-Titration Set.
Permanent marker			Preferably black
Petri dishes			90 X 15 mm dishes; commonly used for bacteriological culture
PLA 3D Printing Filament	Quantum3D Printing	http://quantum3dprinting.com/	High quality polylatic acid filament (PLA), strongly recomended, (1.0 kg Roll), any brand
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Propyl gallate (CAS number 121-79-9); powder; ≥98%; molecular weight = 212.2 0g/mol; solubility in ethanol at 50 mg/ml
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol; solubility in water at 100 mg/mL
Rectified shafts			8 x 300 mm, any brand
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/mol
Rubber bands			Can be replaced with pieces of a string
Screwdriver			To assemble some of the 3D-printed apparatuses
Screews			M3 x 8 mm
SD Card			At least 32Mb in size; usually provided with 3D printers
Software Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG	https://www.repetier.com/	Excellent slicing software, available free of cost
Software Tinkercad	Autodesk	https://www.tinkercad.com	3D model design software, available free of cost
Stereomicroscope	Leica	M-80	Stereomicroscope, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led light source
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1);
Tris	Amersham Biosciences	17-1321-01	Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (CAS number 77-86-1); 99,8-100.1%; molecular weight 121.14 g/mol
Tweezer/forceps	Stark	ST08710	Histological tweezer, straight, round tip, 12 cm, AISI-410 stainless steel
w1118 fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line used as genetic background control for 3XtubAOX
Wood plate			240 x 60 x 20 mm
Zip tights			2 x 210 mm, any brand