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  • 参考文献
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摘要

在这里，该协议介绍了用于 体内 腹膜内给药的柚皮素溶液的制备。柚皮素完全溶解在二甲基亚砜，吐温80和盐水的混合物中。通过血糖试验、酒石酸盐耐酸性磷酸酶染色和酶联免疫吸附试验评估柚皮素的抗糖尿病骨质疏松作用。

摘要

化合物（植物化学）溶液的制备是将其应用于药物筛选等研究之前被忽视但至关重要的步骤。化合物的完全溶解对于其安全使用和相对稳定的结果是必要的。在这里，以制备柚皮素溶液及其在高脂肪饮食和链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型中腹膜内给药的方案为例进行了演示。使用少量柚皮素（3.52-6.69 mg）测试其在溶剂中的溶解性，包括乙醇，二甲基亚砜（DMSO）和DMSO加在生理盐水（PS）中复溶的吐温80。通过观察溶液的颜色，离心后沉淀物的存在（2000× g 持续30秒）或让溶液在室温（RT）下静置2小时来确定化合物的完全溶解。获得稳定的化合物/植物化学溶液后，可以在仅溶剂（无PS）储备溶液中制备 体内研究所需 化合物的最终浓度/量，然后根据需要与PS稀释/混合。通过测量血糖、骨量（显微CT）和骨吸收率（TRAP染色和ELISA）评估柚皮素对小鼠的抗糖尿病骨质疏松作用（腹膜内给药20mg / kg b.w.，2mg / mL）。寻找详细的有机/植物化学溶液制剂的研究人员将从这项技术中受益。

引言

随着关于使用植物化合物进行药物筛选的研究越来越多，制备植物化学溶液以评估其最佳效果的方法值得关注。制备化合物1时需要考虑许多方面，例如溶出方法、剂量和浓度。

溶剂型溶解广泛用于有机化合物制备1.常用的溶剂有水、油、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙醇、甲酸、吐温、甘油等2。虽然当通过胃管饲法施用化合物时，可以使用未溶解物质的悬浮液，但完全溶解的溶质对于静脉内给药至关重要。由于油溶液、混悬液和乳液可引起毛细血管栓塞，因此建议使用水溶液制备化合物，特别是在静脉内、肌肉内和腹膜内注射时3。

有效剂量范围因化合物而异，甚至在用相同化合物治疗的疾病之间也有所不同。有效和安全剂量以及浓度的确定取决于文献和初步实验4.这里以柚皮素化合物的制备为例进行演示。

柚皮素（4，5，7-三羟基黄烷酮）是一种多酚化合物，已被研究用于疾病治疗，其保肝5，抗糖尿病6，抗炎7和抗氧化活性8。对于体内应用，通常使用柚皮素的口服给药。以前的研究报告了在0.5%-1%羧甲基纤维素，0.5%甲基纤维素剂量，0.01%DMSO和生理盐水（PS）中以50-100mg / kg制备柚皮素溶液，通过口服强饲法9，10，11，12给药。此外，其他研究报告了以3.6 g / kg / d的剂量口服摄入的柚皮素（wt / wt）补充柚皮素13，14。研究还报道使用乙醇（0.5% v/v）、PS 和 DMSO 溶解柚皮素，用于腹腔注射，剂量为 10-50 mg/kg15，16，17，18。在颞叶癫痫的研究中，小鼠接受注射悬浮在溶解在PS19中的0.25%羧甲基纤维素中的柚皮素。尽管这些研究报告了使用不同的溶剂来制备柚皮素溶液，但尚未报告进一步的细节，例如溶解状态和动物反应。

该协议介绍了制备柚皮素溶液的程序，用于糖尿病诱导的骨质疏松症的 体内 应用。注射液的制备包括制备溶剂和化合物、剂量估算、溶解过程和过滤。根据文献研究和初步实验，通过监测小鼠每天注射3天后并根据小鼠行为修改剂量来确定剂量。最终选择的浓度（20mg / kg b.w.）在高脂肪饮食和链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠中每周5天腹膜内施用8周20，21。通过血糖检测、显微CT、酒石酸盐耐酸性磷酸酶（TRAP）染色和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估柚皮素对糖尿病骨质疏松症的影响。

总体而言，观察到浓度范围为40-400mg / mL的柚皮素未完全溶解在乙醇或DMSO或5%（乙醇或DMSO）加95%PS（v / v）中。然而，柚皮素完全溶解在3.52%DMSO，3.52%吐温80和92.96%PS的混合物中。详细的程序将有助于研究人员制备化合物作为 体内 应用的注射溶液。

研究方案

所描述的调查符合国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》，并得到上海中医药大学动物护理和使用委员会的批准。进行实验时，出于安全目的，需要实验室外套、一次性丁腈手套和护目镜。

1. 体内 应用所需溶剂的制备和柚皮素的估算

  1. 制备以下溶剂:吐温-80（最终浓度范围:0.5%-1%），DMSO，甘油（最终浓度范围:15%-20%），乙醇（最终浓度范围:肌内注射为12%）22和0.9%PS。
  2. 根据剂量，小鼠数量和注射频率估计所需的柚皮素量。
    1. 订购10只小鼠（C57BL / 6，雄性，5周龄，SPF）每周5天给予柚皮素，持续8周。将小鼠保持在特定的无病原体（SPF）条件下。
      注意:腹膜内注射所需的剂量为20毫克/千克体重23。
    2. 根据以下计算称量160mg柚皮素:20mg / kg x 0.02 kg /小鼠x 10只小鼠x 5天/周x 8周= 160mg。
  3. 计算 体内注射的柚皮素浓度。
    1. 根据小鼠的体重准备推荐的体积。应用于每只小鼠的柚皮素的推荐体积为体重的1%（0.3mL）。在该实验中，每只小鼠使用0.2 mL。
    2. 计算总体积:每只小鼠 0.2 mL x 10 只小鼠 x 5 天/周 x 8 周 = 80 mL。
    3. 计算库存柚皮素的浓度:160 mg/80 mL 溶剂 = 2 mg/mL。
    4. 计算每天的体积:每只小鼠0.2mL x 10只小鼠= 2 mL。

2. 解散

  1. 乙醇溶液
    1. 要以 2 mg/mL 制备柚皮素溶液，称取 3.52 mg 柚皮素并将其加入 2.0 mL 管中。
      注意:要达到 2 mg/mL 的浓度，所需的总体积为 1760 μL（计算:3.52 mg/1760 μL = 2 mg/mL）。
    2. 快速向下旋转（2000 x g 30秒），使柚皮素粉末沉淀在管底部（图1A）。
    3. 向管中加入 8.8 μL 100% 乙醇，以制备相对于所需总体积的 0.5% （v/v） 溶液2.柚皮素不完全溶解（图1B）。
    4. 继续向试管中加入 79.2 μL 100% 乙醇，以制备相对于所需总体积的 5% （v/v） 溶液（计算:（79.2 μL + 8.8 μL） / 1760 μL x 100% = 5%）。柚皮素不完全溶解（图1B）。
    5. 如步骤 2.1.4 所述，将 1672 μL 的 0.9% PS 加入含有 5% 乙醇的管中。这将产生乳液（图1D）。离心（2000× g ，30秒）溶液以检查柚皮素是否完全溶解在溶液中。溶液中出现未溶解的柚皮素的白色沉淀（图1E）。
  2. 二甲基硅安全方案
    1. 要以 2 mg/mL 制备柚皮素溶液，称取 3.95 mg 柚皮素并加入 2.0 mL 管中。
      注意:要达到 2 mg/mL 的浓度，所需的总体积为 1975 μL（计算:3.95 mg/1975 μL = 2 mg/mL）。
    2. 快速向下旋转（2000 x g 30秒），使柚皮素粉末沉淀在管底部。
    3. 向试管中加入 9.8 μL DMSO 以制备 0.5% （v/v） 溶液（计算:9.8 μL/1975 μL x 100% = 5%）。柚皮素完全溶解（图2A）。
    4. 向试管中加入 88.2 μL DMSO，以制备相对于所需总体积的 5% （v/v） 溶液（计算:（88.2 μL + 9.8 μL） /1975 μL x 100% = 5%）。柚皮素完全溶解（图2B）。
    5. 向步骤2.2.4制备的溶液中加入1877μL的0.9%PS（95%的v / v百分比）。产生乳液（图1C）。离心（2000× g ，30秒）溶液以检查柚皮素是否完全溶解在溶液中。溶液中出现未溶解的柚皮素的白色沉淀物（图1D）。
  3. 吐温-80 和 DMSO 解决方案
    1. 要以2mg / mL制备柚皮素溶液，称取6.69mg柚皮素并加入5.0 mL管中。
      注意:要达到 2 mg/mL 的最终浓度，所需的溶液总体积为 3345 μL（计算:6.69 mg/3345 μL = 2 mg/mL）。
    2. 快速向下旋转（2000 x g 30秒），使柚皮素粉末沉淀在管底部。
    3. 加入 117.7 μL DMSO 以制备相对于所需总体积的 3.5% （v/v） 溶液（计算:117.7 μL /3345 μL x 100% = 3.5%）。柚皮素完全溶解（图3A）
    4. 向步骤 2.3.3 制备的溶液中加入 117.7 μL 吐温 80，以获得 3.5% （v/v） 吐温 80 和 3.5% （v/v） DMSO。观察柚皮素的完全溶解（图3B）
    5. 将步骤2.3.4中制备的溶液缓慢加入含有3109.6μL的0.9%PS（93%的v / v百分比）的5.0mL管中，并摇匀以获得明显的柚皮素溶液（图3C）。
    6. 让步骤2.3.5中制备的溶液在室温（RT）下停留2小时。溶液仍然很明显，没有任何可见的沉淀物（图3D）。
  4. 柚皮素溶液的制备用于 体内 给药
    1. 按照步骤1.2.2，称取160毫克柚皮素（160毫克/2毫克/毫升=80毫升）。
    2. 加入 2.8 mL DMSO 以获得 3.5% （v/v） 溶液（计算:2.8 mL / 80 mL x 100% = 3.5%）
    3. 然后，向步骤2.4.2制备的溶液中加入2.8mL吐温80，以获得3.5%（v / v）吐温80和3.5%（v / v）DMSO。
    4. 将步骤2.4.3中制备的溶液分装到四个管中，每管1.4mL[（2.8mL + 2.8mL）/ 4 = 1.4mL]。
    5. 将 18.6 mL 的 0.9% PS 分装到五个 15 mL 管中。
    6. 将步骤2.4.3（储备溶液）和2.4.5中制备的溶液储存在4°C（2.8mL + 2.8mL + 18.6mL x 4 = 80mL）。
    7. 取 140 μL 储备溶液（步骤 2.4.3），并将其与 1860 μL 0.9% PS 混合，制备 2 mL 柚皮素溶液，给药 1 天。
    8. 通过0.2μm过滤器过滤溶液。

3.柚皮素溶液给药

  1. 处理和约束
    1. 在打开盖子之前，用 70-75% 的酒精喷洒笼子和手。抬起鼠标的尾巴底部，将其放在坚固的表面上，将其尾巴轻轻地向后放置。
    2. 用左手拇指和食指抓住耳朵后面的脖子，将尾巴放在小指和无名指之间。保持鼠标仰卧位，后端略微抬高。
  2. 注射
    1. 抓住鼠标的背部皮肤，使腹部皮肤绷紧。
    2. 将针头（胰岛素注射器）在针头和腹部表面之间以 10° 的角度推入腹部右下象限或左下象限，以避免撞击膀胱、肝脏或其他内脏器官。
    3. 将针头沿颅骨方向皮下敷3-5毫米，然后以45°角插入腹腔。
    4. 当针穿过腹壁并且阻力消失时，进行抽吸以确认没有回流物质被抽出。然后，慢慢推动解决方案。
    5. 注射后，慢慢拉出针头并稍微旋转以防止泄漏。推荐体积为 50-100 μL/10 g。
    6. 将剩余的柚皮素丢弃在生物危害容器中。

4. 血糖检查

注意:注射前 1 天和注射后 1 个月和 2 个月测试血糖。

  1. 在血糖测试前将小鼠禁食15小时。可以继续供水。
  2. 打开试纸并标记日期。打开后，请在 3 个月内使用试纸。将试纸储存在2-30°C。 取下条带后盖紧盖子，防止形成水分。
  3. 将动物放入诱导室。异氟醚的诱导水平为 4%，氧气的感应水平为 4 L/min。动物完全麻醉后，将鼻锥麻醉剂和麻醉剂输送保持在异氟醚的1.5%和氧气的0.4L / min的水平。
  4. 用浸泡在70%-75%酒精中的棉球/棉签擦拭尾巴。
  5. 从尾巴的最低点开始，用25G的针刺在尾侧静脉上做一个小刺，挤出一滴血。
  6. 用纸巾擦拭血滴。
  7. 挤出另一滴血并将其收集在试纸的边缘。
  8. 读取并记录血糖仪上显示的结果。
  9. 为了止血，用无菌纱布捏住老鼠的尾巴，然后用75%的酒精擦拭该区域。
  10. 可以通过类似的技术在尾巴上颅移动来获得额外的样品。

5. 陷阱染色

  1. 载玻片准备
    1. 每周对小鼠进行一次空腹血糖测试。当血糖水平≥11.1 mmol/L（表明成功的II型糖尿病小鼠模型24）时，使用CO2对小鼠实施安乐死，然后颈椎间盘定位，并收集腰椎4-6th（L4-L6）（空腹血糖测试时不进行安乐死）。
    2. 用4%多聚甲醛固定L4-L6样品24小时（确保多聚甲醛的体积为>组织体积的20倍），然后在连续流动的自来水中洗涤2小时。
    3. 要使样品脱钙，请将其浸入10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，在室温下静态条件下2周，直到样品软化。确保脱钙溶液的体积是组织/样品体积的20-30倍。每隔一天更换一次EDTA解决方案。
    4. 使用脱水机使样品脱水。
      1. 将标本放入组织处理包埋盒中。用铅笔对磁带进行编号。
      2. 脱水机程序设置如下:75%酒精2小时，85%酒精1小时，95%酒精1小时，95%酒精2小时，无水乙醇（I）2小时，无水乙醇（II）2小时，无水乙醇（III）2小时，二甲苯（I）1小时，二甲苯（II）1小时，二甲苯（III）1小时， 石蜡（I）在室温下2小时，石蜡（II）2小时。
    5. 将样品嵌入石蜡中。
      1. 将石蜡加入石蜡包埋站的盒式托盘中，加热至60°C。 将脱水的标本浸泡至少2小时。
      2. 将组织盒放入盒托盘中并预热。
      3. 将石蜡加入石蜡储液器中，加热至60°C。
      4. 2小时后，将组织盒和标本带到工作区域。将预热的石蜡从石蜡储液器中倒入组织盒中。将标本放入石蜡中，确保石蜡完全覆盖组织，然后立即将盒式磁带移动到糖衣台上。
      5. 使用切片机将石蜡包埋的样品切成 5-6 μm 部分。在40°C温水中展开切片少于10秒。收集APS（氨基硅烷）涂层载玻片上的切片。将载玻片在室温下干燥1小时，然后将载玻片移至60°C的烤箱中过夜。
  2. 捕集阱试剂制备
    1. 制备基础储备培养液:将9.2g无水乙酸钠，11.4gL-（+）酒石酸和2.8mL冰酸溶解在1000mL蒸馏水中。将pH调节至4.7-5.0，并在室温下储存长达6个月。
    2. 制备萘酚醚溶液:将 0.1 g 萘酚 AS-BI 磷酸盐溶解在 5 mL 乙二醇单乙醚中。在4°C下储存长达5周。
    3. 准备亚硝酸钠溶液:将1克亚硝酸钠溶解在25毫升蒸馏水中。储存在4°C。
    4. 制备对位苯胺染料:将 1 g 对位苯胺碱加入 20 mL 的 2N HCl（83 mL HCl 在 417 mL 水中）。使用前使用搅拌板溶解基质并过滤。
  3. 捕集染色
    1. 用50mL碱性储备液填充两个Coplin罐，并置于37°C烤箱中2小时。
    2. 取一个科普林罐，加入 0.5 mL 的纳波仑醚溶液。
    3. 将载玻片放入Coplin罐中，并在37°C孵育1小时。
      注意:每组至少准备三张幻灯片。
    4. 在孵育时间结束前几分钟，加入 1 mL 亚硝酸钠溶液和 1 mL 对位苯胺染料。轻轻混合30秒，静置2分钟。
    5. 将步骤5.2.2中制备的溶液加入到另一个预热的含有碱性储备溶液的Coplin罐中。充分混合溶液，并在步骤5.3.3中插入Coplin罐中的载玻片。
    6. 在室温下孵育15-20分钟。
    7. 用 200 mL PBS 在另一个 Coplin 罐中冲洗切片 5 分钟。
    8. 在科普林罐中用100%苏木精对切片复染30秒。
    9. 用 85%、95% 和 100% 酒精 （200 mL） 分别对切片脱水 2 分钟，并在二甲苯 （200 mL） 中处理 2 分钟，每次 3 分钟。 使用科普林罐执行每个步骤。
    10. 使用树脂用盖玻片固定盖玻片上的部分。确保避免气泡被捕获。

6. 酶联免疫

  1. 样品制备
    1. 从小鼠的股骨和胫骨中取出软组织。用纱布清洁骨头。
    2. 将骨样品放入1mL微量离心管中，并将样品管储存在-80°C。
      注意:样品也可以在液氮罐中储存不超过6个月。
    3. 称量骨头样品。用0.9%PS以1:10的比例稀释。例如，用 1 mL PS 稀释 0.1 g 骨头。
    4. 将 3 mm 氧化锆珠加入管中，并在 70 Hz 下研磨样品 3 次 30 秒，中间休息 20 秒。
    5. 将样品在4°C和12，000× g 下离心5分钟。收集上清液。
  2. 酶联免疫吸附法检测试剂盒
    注意:根据制造商指定的测定方案进行 ELISA。
    1. 将标准品、空白样品和样品的每种稀释液 100 μL 加入适当的孔中。在37°C孵育90分钟。
    2. 从每个孔中倒出液体，并加入 100 μL 生物素化检测抗体工作溶液。在37°C孵育1小时。
    3. 倒出溶液，向每个孔中加入 350 μL 洗涤缓冲液。浸泡1分钟，重复3次。
    4. 向每个孔中加入 100 μL HRP 偶联物工作溶液。在37°C孵育30分钟。
    5. 倒出溶液。按照步骤6.2.3中的说明重复洗涤过程5次。
    6. 加入 90 μL 底物试剂。在37°C避光孵育15分钟。
    7. 加入 50 μL 终止液。
  3. 使用酶标仪记录每个孔在450nm处的吸光度。
  4. 标准曲线生成
    1. 将各自的平均吸光度值与连续稀释的蛋白质浓度绘制成曲线。
    2. 连接点以创建最佳拟合曲线。使用任何适当的计算机应用程序（电子表格）生成标准曲线方程。
  5. 在标准曲线方程中代入每个样品的吸光度值，以获得相应样品的浓度。

结果

发现高脂肪饮食喂养和STZ诱导的糖尿病小鼠的体重在STZ治疗后0-8周与对照组相比降低。与未治疗的小鼠（STZ组）相比，柚皮素治疗的小鼠在第4周的体重减轻是显着的。对照组和STZ组用相同体积的PS施用（表1）。糖尿病小鼠的血糖水平在STZ诱导后1个月内显着升高。然后它自动降低到2个月前建立动物模型时观察到的水平。柚皮素治疗在1个月和2个月时分别降低了51.8%和34.8%的血糖水平（

讨论

植物化学溶液的制备是其在 体内应用的基础。在该协议中，通过使用不同的溶剂（例如乙醇，DMSO，吐温80和0.9%PS）证明了柚皮素溶液的制备。完全溶解状态的溶液需要进一步监测，使其在室温下保持更长时间，然后在 体内使用前过滤。

溶剂测定是该方案中的关键步骤。溶解化合物的溶剂有很多选择，其中乙醇、DMSO 和 PS 使用最广泛。乙醇由于其高极性特性，可...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（81973607和81573992）的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL  microtubesCorning Science (Wujiang) Co.23218392Holding liquid
Automatic DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA ASP 300SDehydrate samples
Blood glucose test stripsJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.4130392
CentrifugeMIULABMinute centrifugeCentrifugal solution
DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA  ASP300SDehydration
DMSOSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E918BA0041Co-Solvent
ELISA assay kitElabscience Biotechnology Co.,LtdMouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c
Mouse  CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c
Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c
Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c
Ethanol absoluteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Co-Solvent
Ethylene glycol monoethyl etherSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.A501118-0500TRAP staining
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009617Decalcification
FilterMerck Millpore LTD.Millex-GP, 0.22 µmfilter solution
Glacial acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218TRAP staining
Glucose meterJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.One Touch Ultra VueSerial number:COJJG8GW
GrinderShanghaijingxin Experimental TechnologyTissuelyser-24
HematoxylinNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD005TRAP staining
Insulin syringeShanghai Kantaray Medical Devices Co.0.33 mm x 13 mm, RW LBIntraperitoneal injection
L-(+) tartaric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd100220008TRAP staining
MicroscopeOLYMPUSsz61Observation
MicrotomeLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA RM 2135Section
Mini centrifugeHangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. Mini-6KCCentrifuge
Naphthol AS-BI phosphateSIGMA-ALDRICHBCBS3419TRAP staining
NaringeninJiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd102764Solute
Paraffin Embedding stationLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 CEmbed  samples
Pararosaniline baseBBI Life SciencesE112BA0045TRAP staining
Pipetteseppendorf2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL  transferre Liquid
Plate readerBioTek Instruments USA, Inc.BioTek CYTATION 3 imaging readerELISA
ResinShanghai Yyang Instrument Co., Ltd.Neutral balsamTRAP staining
saline (0.9 PS)Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,LtdA6E1323Solvent
Sodium acetate anhydrousSinopharm Chemical ReagentCo., LtdMerck-1.06268.0250 | 250gTRAP staining
Sodium nitriteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10020018TRAP staining
Tween-80Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E819BA0006Emulsifier
Zirconia beadsShanghaijingxin Experimental Technology11079125z 454gGrinding

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