用于果蝇消费量化的高吞吐量微板馈线分析

摘要

微板进料检测为测定 果蝇的液体食品消费量提供了经济、高的吞吐量方法。3D 打印设备将 96 井微板连接起来，其中苍蝇被安置在 1536 井微板上，苍蝇从微板中消耗带有示踪剂染料的喂食溶液。解决方案体积下降是光谱光谱测量。

摘要

对 果蝇 食物摄入量进行量化，用于研究与消费相关的特征的遗传和生理基础、其环境因素以及多种物质的毒理学和药理学作用。目前实施的方法很少能适应高吞吐量测量。微板喂食器检测（MFA）是为利用吸收量对个别苍蝇的液体食物消耗进行量化而开发的。在这种测定中，苍蝇从1536井微板的选井中消耗液体食物介质。通过将稀释的微量染料加入液体食品介质中，并将已知体积加载到每口油井中，消耗前后获得的油井的吸水度测量反映了由此产生的体积变化（即消耗量）。为了使用这种方法进行高吞吐量分析，设计了一个3D打印的耦合器，允许苍蝇单独分类到96井微板中。该设备精确定位 96 井和 1536 井微板，使每只苍蝇最多可进入 4 口井供食用，从而在常规消费之外实现食物偏好量化。此外，该设备还具有在开放位置和封闭位置之间切换的屏障条，以便一次控制包含和释放一列样品。这种方法使许多苍蝇同时能够高吞吐量地测量溶液的消耗量。它还有可能适应其他昆虫，并筛选营养物质、毒素或药物的消耗。

引言

果蝇黑色素加斯特已经看到广泛使用作为一个基因模型有机体来研究食物摄入的生物基础和与消费相关的特征^1。据估计，65%的人类致病基因在苍蝇体内具有功能同源性，其中相当一部分在苍蝇^{和人类之间的}功能等效组织中表达。此外，D.黑色素加斯特的体积大、代际时间短、维护简单、遗传可携带性等，是^{研究各种物质}（包括杀虫剂^5种、污染物⁶种、药物⁷种、滥用药物⁸种^、9种^、10种）毒理学和药理作用的诱人模式。

在许多情况下，对此类特征的研究需要精确量化消费。量化消费的方法多种多样，包括Capillary FEeder（CAFE）检测^11，马努尔FEeding（MAFE）检测^12，普罗博斯扩展反应（PER）检测^13，示踪剂染料提取14，15，寡核苷酸微量提取^16，无线电同位素提取^5，17。最近的努力集中在提高这些检测的吞吐量，如在快车检测¹⁸或板为基础的全动物喂养FLat（WAFFL）系统^19。尽管这些检测有其效用，但它们可能很复杂、成本高昂或劳动密集型，妨碍了它们在高吞吐量研究中的使用。

图1:微板馈线器检测组件。（A） 组装微板进料器检测的3D渲染。1536 井微板由 3D 打印耦合器定向，因此下 96 井微板的每口井都可以接触到上部 1536 井微板的四口井。通过调整通过耦合器的隔栅条的位置，可以控制进入油井。（B） 微板进料器检测中每口井的图形表示。使用已穿孔的密封膜，每个油井都保留使用消耗解决方案，以便苍蝇进入。请单击此处查看此图的较大版本。

图2:微板馈线检测程序概述。 该图显示了对应协议步骤 4.1-5.8 的流量图。 请单击此处查看此图的较大版本。

为了克服这些障碍，微板馈线分析（MFA;图1）被开发。在这项检测中，苍蝇被单独安置在96井微板中。每个微板都使用自定义的 3D 打印设备耦合到 1536 井微板上。该装置精确定位了两个板，使每个飞在其各自的96井板井有4井的1536井微板。通过使用无底 1536 井板和密封膜，溶液被分配到选定的井中，并用直径为 0.25 mm 的精确针穿孔，以方便苍蝇进入。关键是，允许直接从微板进行消耗，允许使用微板读取器进行基于吸附的即时测量。稀释剂染料被纳入消费介质，暴露后吸收的变化用于确定消耗量（图2和图3）。由于每个井中的液体接近一列液体，因此体积差异将表现为柱高的差异。（图3A）根据啤酒兰伯特法^20:

其中A是吸收，ε是摩尔吸收系数的衰减分析，l是光学路径长度，c是衰减分析的浓度。因此，随着摩尔吸收系数和浓度的不断变化，吸收率的变化完全是由于光学光路径的变化，即给定井内的流体水平。通过测量暴露前后的吸收量，吸收量的成比例变化反映了体积的成比例变化（图3B）。

图3:以吸水为主的井体积量化。（A ）已知输入强度（I_0）的事故光穿过每口井。不同填充体积的光衰减产生不同的输出强度（I），表现出体积和吸附之间的线性关系。（B） 吸收量与体积的实证测量。请单击此处查看此图的较大版本。

根据体积的变化，可以根据喂养溶液中已知浓度计算任何摄入化合物的量。检测所需的部件成本低，可重复使用性强，大大降低了检测的重复成本。因此，此程序提供了一种经济实惠的高吞吐量方法，精确量化消费。

研究方案

1. 饥饿板准备

1. 将 1.5 克的阿加罗斯称重到 250 毫升玻璃烧杯中。
2. 在烧饼中加入 100 mL 蒸馏 H₂O。
3. 微波间歇性，直到玫瑰完全熔融。
   注意:观察烧甲机，因为烧结容易沸腾。
4. 将熔融的藻醇倒入试剂槽中，然后使用多通道移液器将 80 μL 的熔融藻醇排入 96 井微板的每口井中。允许板在室温下覆盖时治愈。将剩余的玫瑰在密封的袋子中冷藏长达一周，并重新熔化以制作额外的盘子。

2. 飞行分类和饥饿

1. 通过将障碍条插入障碍条通道来准备耦合器。如果屏障条太松，则将它们绕在手指周围，使其曲率无法将它们保持在通道中。
2. 把耦合器贴在饥饿板上。不要使用耦合器操纵板，因为耦合器可能会滑落。确保耦合器正确定位（即确保耦合器的角与微板的角度角匹配）。
3. 在_CO2 麻醉（材料表）下，排序3-5天老苍蝇。将单个苍蝇逐列装载到饥饿板中。
   注:虽然苍蝇按列加载，但建议将样品组分布在板的下行，而不是向下列（请参阅 图 4 以示板布局示例）。
4. 通过将障碍条调整到封闭位置，在填充时关闭每个列。

图4:代表饥饿板布局。 该图显示了蒸发控制和雄性苍蝇在这项研究中使用的96井板的组织。还可使用替代配置，包括在 A 排和 H 排中具有蒸发控制的男性和女替行。 请单击此处查看此图的较大版本。

5. 仔细记录微板内的示例布局。一旦饥饿板被填充，让苍蝇在去除_CO2 后自发恢复，并饿死他们从最初的麻醉时间开始6小时。

3. 液体食品制备

注意:每天使液体食品新鲜。

1. 在蒸馏 H₂O 中准备 10 毫克/毫升的 FD&C Blue #1 染料库存溶液。
   注:可在室温下储存长达6个月。
2. 在 15 mL 圆锥形管中，通过溶解 0.4 克蔗糖和 0.1 克酵母提取物（蒸馏 H 2 O. Vortex 管中溶解 0.4 克蔗糖和 0.1 克酵母提取物，将 10 mL 蒸馏 H₂O. Vortex 管中溶解）中准备 10 mL 液体食品。10 mL 液体食品（1% 蔗糖、1% 酵母提取物、40 微克/mL FD+C Blue #1）。加入 40 μL 的染料库存溶液，并反复倒置管子以使溶液均质化。
3. 将液体食品转移到一个10mL注射器倾斜与0.45μm过滤器。将溶液的 ±1.5 mL 一次过滤成 1.7 mL 微中心管。将包含溶液的注射器放在一边，并在进料板制备过程中根据需要过滤其他溶液。

4. 喂食板制备

注意:灌装后轻轻处理进料板，以防止在油井中形成气泡或液滴，这可能会影响吸附读数。

1. 用密封膜密封 1536 井微板的底部，准备支线板。使用密封桨彻底粘附在薄膜上。用剃须刀刀片修剪左右边缘的多余薄膜。
2. 将过滤后液体食品柱的 10 μL（见 图 5 以示示）分配到 1536 井微板的适当井中。每组四口井向左上侧井中分配（见 图5 图示）。

图5:为1536井支线板填写订单和井位置。 该图说明了协议的第 4.2 步。箭头显示从第 1 列到 12 列一次在进料板中引入馈送解决方案的顺序。示例 B1 被放大，以显示 1 选择和 2 选择测定的进给解决方案的位置示例。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 一旦所有的油井都填满了，在盘子的顶部涂上密封膜。使用密封桨彻底粘附在薄膜上。用剃须刀刀片修剪左右边缘的多余薄膜。重复上述步骤，以获得所需的车牌数。
4. 将板离心在 200 x g 10s 以沉积流体。不要让板被冷却，因为这会导致凝结积聚在井中，遮挡吸收读数。

5. 曝光

1. 一旦苍蝇准备好进行食用检测，用装有直径为0.25毫米的针头的针头探针工具穿孔盘顶表面的井。使用与分配解决方案时相同的顺序穿孔。翻转盘子，打孔底部的井。擦去溶液之间的针头，以防止交叉污染。小心不要触摸穿孔，因为这会使井中的溶液变为芯。
2. 在没有盖子的情况下，在 630 nm 下读取板的吸光度。
3. 在顶部密封膜上放置一个内部盖子，以确保冷凝环包围穿孔井。将外部盖子放在盘子上。
4. 将喂食板正面朝上放在耦合器上，以便导引对馈板和饥饿板的适当孔对齐。确保耦合器和板正确定位（即确保耦合器的角度角与板匹配）。将弹性带包裹在顶部和底部的板材上，将耦合器粘合在一起。检查进料板和耦合器之间的对齐和间隙。
5. 一旦所有的进料板都装到耦合器上，通过调整耦合器上的屏障条来打开板的井。将耦合器/板组件放在辅助容器中。每个辅助容器最多可容纳六个组件。
6. 将装有浸泡纸巾的移液器盒的下半部分放入每个次要容器中，以提供湿度。关闭次要容器的盖子，将其转移到受控环境中（25 °C，湿度控制，12h 光:暗循环）。允许苍蝇消耗22小时。
7. 22 小时曝光后，检查每个板是否有死苍蝇，并相应地更新板布局。检查完所有盘子后，通过在辅助容器内泵送 CO₂来对苍蝇进行集体麻醉。60 后，确保所有苍蝇都固定。轻轻地将苍蝇夹入饥饿板，并更换塑料屏障条。取出进料板以进行读取。
8. 在 630 nm 重读板的吸光度。重复上述步骤，直到所有板都读完。

6. 数据分析

注:分析可以用调查员首选的软件包进行。

1. 省略在22小时暴露期间死亡的苍蝇。
2. 对于每口井，计算消耗的体积如下:
   
   C - 消耗量 （μL）
   V - 初始井体积（即 10 微升）
   ABS₀ - 暴露前吸收
   ABS₁ - 暴露后吸收
   注:在计算中，消费表示为正量。
3. 要考虑蒸发，从各自板块内的苍蝇消耗值中减去平均蒸发量。对于 2 选择/首选测试，根据各自的解决方案调整每口油井，例如，通过蒸发控制中的"选择 1"调整"选择 1"井。
4. 调整蒸发后，丢弃任何消耗值低于零的样品。
5. 对于 2 选择测试，计算每个选项的首选项以及:
   
   P - 偏好指数（正方向表示偏好）
   F_A - 含添加剂的液体食品消耗量（选项2）
   F_N - 消耗的正常液体食品量（选项 1）

7. 微板和耦合器清洗协议。

注意:注意防止微板底部损坏，因为损坏会影响密封。

1. 从 1536 井微板中取出薄膜和标签。将耦合器和屏障条分开。将屏障条放在密封容器中，如瓶子。通过在一系列温水、温和洗涤剂溶液、温自来水中大力摇晃来清洗屏障条，然后蒸馏 H₂O。
2. 在温暖的自来水下冲洗 1536 井微板和耦合器。对于微板，通过每个微板井运行自来水，以清除尽可能多的溶液和碎屑。如有必要，使用移液器尖端清除碎屑;不要在盘子上使用金属或玻璃器皿。
3. 用温和的洗涤剂溶液（例如，1% v/v Aquet）覆盖每个盘子和耦合器。对于盘子，用戴手套的手擦洗表面。对于耦合器，使用刷子。
4. 用自来水彻底冲洗每个盘子，然后用蒸馏的_H2O。确保井在水流下经过专门冲洗。
5. 让板材和耦合器在室温下干燥通风。存放在干净的存储箱中，直到使用。
   注意:切勿在没有手套的情况下处理 1536 井微板。皮肤残留的油会阻碍密封，导致油井泄漏和蒸发。

结果

为了确定单个板块的油井之间是否存在任何相关性，每个油井（n = 96 井/三个板的蒸发）都进行了量化。蒸发被发现为 -0.036 μL ± 0.003 μL（意味着整个 SEM ±）。（图6A）皮尔逊相关性被计算为评估蒸发和井位之间的趋势。蒸发与行的相关系数（图6B，C）为-0.04（p = 0.4949），蒸发与柱的相关系数为-0.23（p = 0.0001）。随后，各列之间分布了组，以减轻各列之间温和但具有统计学意义的相关性。

图6:蒸发在MFA.（A）蒸发变化的密度分布与平均±SD指示的虚线。蒸发与行（B）或列（C）之间的相关性与所示的 Pearson 相关系数和 p 值。请单击此处查看此图的较大版本。

为了确定协议的有效性，对3-5天老 的广S B 苍蝇（n = 36/性别/板和 n = 24 蒸发控制/板为三个板）（图7）进行量化。对照井中的蒸发量与零（-0.030 μL ± 0.006 μL，p = 4.81 x 10^-6;一个样品 t-测试与零）有显著差异。数据集中省略了两个样本（均为男性），一个样本在夜间暴露期间死亡，另一个样本在蒸发调整后消耗值为负值。这产生了> 99% 的样本保留率。

图7:使用MFA（A）消费量化使用定制制造的玻璃室可视化。观察到苍蝇在穿孔井中饮用，并在摄入染色溶液后表现出蓝色腹部染色。另见补充视频S.1.（B）在蒸发控制，雄蝇和雌蝇之间的消费值（平均±SEM）。对统计比较进行了具有不平等差异的对后 t测试，其意义由条形图表示。请单击此处查看此图的较大版本。

随后，根据 Y = μ = S = P = SxP + e 所描述的方差分析 （ANOVA） 模型，以 Y 为组均值，以μ为整体平均值，将 S 描述为性别的固定效果，将 SxP 描述为板的固定效果，将 SxP 描述为性与板之间的相互作用，将 e 描述为残余变异性。ANOVA 显示，消费没有显著的板块对板变异性（p = 0.671）或与板块（p = 0.104）的性别特定相互作用，而仅靠性别就显著促成了观察到的消费变化（p = 4.17 x 10^-18）。特设 t- 测试后显示，男性消费明显低于女性（0.500 μL ± 0.017 μL vs 0.811 μL ± 0.028 μL，p = 1.13 x 10^-17，两个样本t- 测试具有不平等的差异）。

为了证明该检测可用于两种选择偏好量化，苍蝇可以选择 4% 蔗糖溶液与 1% 酵母提取物和 4% 蔗糖溶液，辅以 15% 乙醇和 1% 酵母提取物。男性和女性都对乙醇和酵母提取物的溶液表现出压倒性的偏好，偏好指数为0.974±男性0.026，女性0.876±0.06（平均±SEM）（图8）。

图8:使用 MFA 进行首选定量。 消费4%蔗糖，而4%蔗糖补充15%乙醇和酵母提取物的雄性苍蝇（n = 33为每性别）。雄性苍蝇消耗的乙醇溶液比对照蔗糖溶液（0.511 μL ± 0.029 μL 与 0.00 μL ± 0.017 μL; p = 4.06e^-10;双样本 t- 测试） 。雌性苍蝇消耗的乙醇溶液也比对照蔗糖溶液多（0.939 μL ± 0.044 μL，而 0.132 μL ±0.044 μL;p = 7.38e^-17;双样本 t-测试）。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充视频S.1:视频显示苍蝇从穿孔井喂养，并在摄入染色溶液时积累蓝色腹部污渍。图7A中显示了静止图像。请点击这里下载此视频。

补充文件S.2:微板喂食器检测耦合器。这是 MFA 中使用的耦合器的 3D 打印结构。印刷材料尼龙 PA12 用于 MFA。 请点击这里下载此文件。

补充文件 S.3: 微板喂食器检测障碍条。 这包含用于将苍蝇暴露在喂食板上的塑料屏障条的设计。单对可以使用多达十二条屏障条。 请点击这里下载此文件。

补充文件 S.4: 微板馈送器检测的拆包和制造说明。 包括拆开耦合器和屏障条的说明。内盖、外盖和用于限制暴露期间蒸发的辅助容器包含制造说明。 请点击这里下载此文件。

补充文件S.5:微板喂食器检测（MFA）和1选择单飞CAPillaryFeeder（CAFE）检测的成本比较。测试72只苍蝇/性别的单行将需要两套MFA设备（耦合+ 板 + 屏障条），而CAFE将只需要1毛细管为每个培养瓶。尽管 MFA 的初始投资差异很大，但经常性成本的巨大差异（分别为 14.80 美元和 46.08 美元）将允许在仅测试 4 行（盈亏平衡点）后收回前期成本。 请点击这里下载此文件。

讨论

这项研究描述了一种用于量化德罗索菲拉消费的新协议:微板喂食器检测（MFA）。在这项测定中，苍蝇通过控制大小的穿孔从1536井微板的密封井中消耗（图1，图2:补充视频 S.1）。由于液体食品是通过微板染色和提供的，因此可以使用微板光谱光谱仪（图3）测量食物的光学吸收度。通过这种方式，消费通过比较消费前后的吸收量来确定，然后将此比例应用于消费前分配的已知数量。通过测量染色介质不同体积的吸收量（图3B），经验验证了这一点。

为了开发这种检测，需要一种能够利用基于吸纳性消费的量化装置。以微板格式测试苍蝇很有吸引力，因为它补充了用于分配食物的微板，并允许通过调整耦合几何形状从多个板格式（例如 6-、12、48 或 96 井格式）中进行选择。选择了 96 井微板格式，以允许个人飞行文化。

3D 打印设备 （图 1）精确定位 1536 井支线板与 96 井培养板，使每只苍蝇可进入多达 4 口进料板井供食用。此外，为了提供足够的时间将苍蝇分发到房屋板中并控制检测启动，该装置包括在各自的井中缠动含有苍蝇的屏障条，并防止违规。提供采购或修改这些部件所需的文件（补充文件S.2-S.3），以及相关件件的必要制作说明（补充文件S.4）。

MFA提供了一个简单的高吞吐量方法，补充了更精细的方法来监测果蝇喂养行为18，21，22。与用于量化食物摄入量的其他方法相比，MFA 具有多种优势。通过使用板读器量化消耗，可以增加吞吐量。这将消除手动测量并避免手动数据输入。数据也可进行程序提取和处理。此外，较高的吞吐量增加了生物复制品的可行数量，特别是与公共馈线设计相比，后者大大提高了检测消耗小差异的能力。使用 MFA，单个实验者可以量化每次检测的夜间运行超过 500 苍蝇的消耗或偏好。通过重叠的检测运行，超过2，000只苍蝇可以在5天的时间内进行测试。最后，由于微板和耦合器的可重复使用性（补充文件 S.5），可以节省长期成本。使用 MFA，每次检测的估计成本可能低至 14.80 美元，设备预付费用为 127.60 美元。使用经典的Capillary FEeder （CAFE） 检测，它需要昂贵的精密微资本，估计每次检测的可比复制次数的成本为 46.08 美元。因此，虽然在购置必要设备方面有前期投资，但经常性成本的降低可带来大量节省，尤其是在进行重复测试的情况下。

与所有分析一样，MFA 也有一定的局限性。主要是，它需要访问能够读取 1536 井微板的微板光谱仪。此外，依靠吸收度测量进行量化，使该方法容易受到光学干扰。这表现为测试的一小部分样品的负消耗值。营养物质、药物、药物或感兴趣的毒素也必须是水溶性的，才能与检测相容。

尽管其局限性，这种方法提供了一个高吞吐量的方法来量化消费行为在 果蝇。此外，耦合装置可以很容易地修改，以接受许多板格式，使其能够容纳各种昆虫物种。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm Diameter Needles	Rave Scientific	RS-MN-52-001012
0.45 µm Syringe Filters	Olympus Plastics	25-245
10 mL Disposable Syringe	EXELINT	26200
Agarose	Fisher Scientific	BP1600
Barrier Strips (Laser Cut)	Ponoko	-	Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File:
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625501
Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets	Eppendorf	22638041
FD&C Blue #1	Spectrum Chemical Mfg Corp	FD110
Film Sealing Paddle	Fisher Scientific	50-563-280
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	#59-114 and #59-119	CO2 Anesthesia: The Flypads  come in two sizes, either of which is appropriate
Microplate Coupler (3D Printed)	Shapeways	-	Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File:
Microplate Lids	Greiner Bio-One	656170
Molecular Devices SpectraMax iD5	Molecular Devices	-	Any microplate reader with 1536-well resolution will do.
Needle Probe Holder	Rave Scientific	RS-MN-52-001000
Polyester Sealing Film	Excel Scientific, Inc.	100-SEAL-PLT
Polystyrene 96-well microplates	Greiner Bio-One	655101
Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates	Greiner Bio-One	783000	Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing.
Rubber Bands
Sucrose	Sigma	S7903
Weather Stripping			1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422