使用无细胞自动诱导工作流程在24小时内从细胞到无细胞蛋白质合成

摘要

这项工作描述了从 大肠杆菌（E. coli） 制备细胞提取物，然后在24小时内进行无细胞蛋白质合成（CFPS）反应。无细胞自诱导（CFAI）方案的解释详细介绍了为减少研究人员的监督和增加获得的细胞提取物数量而进行的改进。

摘要

无细胞蛋白质合成（CFPS）已经发展成为一个 在体外捕获转录和翻译机制的生物技术平台。许多发展使新用户更容易访问CFPS平台，并扩大了应用范围。对于基于裂解物的CFPS系统，可以从各种生物体中产生细胞提取物，利用该宿主的独特生物化学来增强蛋白质合成。在过去的20年中， 大肠杆菌 （E. coli） 由于其可负担性和多功能性而成为支持CFPS的最广泛使用的生物体之一。尽管取得了许多关键进展， 但大肠杆菌 细胞提取物制备的工作流程仍然是新用户为其应用实施CFPS的关键瓶颈。提取物制备工作流程非常耗时，需要技术专业知识才能获得可重复的结果。为了克服这些障碍，我们之前报道了24小时无细胞自动诱导（CFAI）工作流程的开发，该工作流程减少了用户输入和所需的技术专业知识。CFAI工作流程最大限度地减少了生成细胞提取物所需的劳动力和技术技能，同时还增加了获得的细胞提取物的总量。在这里，我们以循序渐进的方式描述该工作流程，以改善可及性并支持基于 大肠杆菌 的CFPS的广泛实施。

引言

在过去几年中，将无细胞蛋白质合成（CFPS）用于生物技术应用的用途大幅增长^1，2，3。这一发展可部分归因于在了解CFPS中发生的过程以及每个组成部分的作用方面所做的努力^，4，5。此外，优化设置和替代能源带来的成本降低使无电池技术更容易为新用户实施^{6，7，8，9}。为了实现蛋白质合成所必需的转录和翻译因子，细胞提取物通常用于驱动无细胞反应¹⁰。最近发布的用户指南提供了用于生产功能提取的简单协议，使新用户和有经验的用户更容易实现^{1，11，12，13，}

研究方案

1. 媒体增长

1. 如 表1 所述制备960 mLCFAI培养基，并使用KOH将pH调节至7.2。
2. 将培养基转移到2.5L挡板烧瓶和高压灭菌器中，在121°C下30分钟。
3. 如 表1所述制备40mL糖溶液。将溶液过滤灭菌到单独的高压灭菌玻璃容器中。
   注意：糖溶液可以储存在30°C的培养箱中，直到进一步使用。
4. 高压灭菌后让培养基完全冷却至40°C以下。
5. 在接种CFAI培养基之前，将糖溶液直接加入CFAI培养基中。
6. 要接种培养基，请从先前有条纹的大 肠杆菌 BL21 Star（DE3）板上滑动一圈菌落，然后直接插入培养基中。将环旋转到介质中，但避免接触容器的侧面。确保条纹板是新鲜的，具有活细胞。
7. 将装有接种培养基的烧瓶置于30°C培养箱中，同时以200rpm振荡。让培养物在一夜之间生长。如果在晚上接种细胞，培养物将在第二天早上达到10的近似光密度，在600nm（OD₆₀₀）处测量。接种和收获时间可根据需要进行调整。

2. 细胞收获

1. 提前准备S30缓冲液并保持低温。根据 表2制备S30缓冲液，最终pH值为8.2。
   注意：S30缓冲液可以在细胞收获前几天制备。如果这样做....

结果

在制备CFAI培养基时，葡萄糖被交换为乳糖和甘油的增加，作为培养基中的主要能量底物。此外，CFAI介质的缓冲能力也得到了提高。这些特定组件如 表1所示。

然后将细胞在CFAI培养基中生长至OD₆₀₀ /10和标准2.5，以显示与提取物质量的一致性，尽管提取量不同。2.5 OD 600 CFAI培养基是在37°C，_200rpm 的LB肉汤中接种后生长的，而OD₆₀₀ 10培养物直接.......

讨论

传统上，研究人员的监督对于细胞生长过程中的两个关键动作是必需的：诱导T7 RNAP和在特定的OD₆₀₀下收获细胞。CFAI避免了这两个要求，以减少研究人员准备高质量细胞提取物所需的时间和技术培训。T7 RNAP的自动诱导是通过用乳糖代替葡萄糖作为培养基中的原糖来实现的，从而避免了以前主动监测生长的需求，然后在细胞生长过程中的精确点用IPTG诱导。还消除了主动监测细胞培养物以特?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microfuge Tubes	Phenix	MPC-425Q
1L Centrifuge Tube	Beckman Coulter	A99028
Avanti J-E Centrifuge	Beckman Coulter	369001
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	BTCYT5F
D-Glucose	Fisher	D16-3
D-Lactose	Alfa Aesar	J66376
DTT	ThermoFisher	15508013
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
Glycerol	Fisher	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100G
HEPES	ThermoFisher	11344041
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter	366754
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A0884-25G
L-Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G1501-500G
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-Histadine	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Serine	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Luria Broth	ThermoFisher	12795027
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500-25G
Mg(Glu)2	Sigma-Aldrich	49605-250G
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661-250G
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
Molecular Grade Water	Sigma-Aldrich	7732-18-5
NaCl	Alfa Aesar	A12313
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator	Eppendorf	M1335-0000
NH4(Glu)	Sigma-Aldrich	09689-250G
NTPs	ThermoFisher	R0481
Oxalic Acid	Sigma-Aldrich	P0963-100G
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic	Acros, Organics	A0382124
Potassium Phosphate Monobasic	Acros, Organics	A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit	ThermoFisher	K210007
Putrescine	Sigma-Aldrich	D13208-25G
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-5G
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
Tryptone	Fisher Bioreagents	73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask	Sigma-Aldrich	Z710822
Ultrasonic Processor	QSonica	Q125-230V/50HZ
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	1/2/8013