通过胸腺肾包膜移植、CD34 + 细胞注射和细胞因子递送生产人源化小鼠

Summary

人源化小鼠模型提供了更准确的人类免疫微环境表示。本手稿描述了通过人胸腺肾移植、注射人 CD34⁺ 细胞以及靶向递送人细胞因子转基因以促进 CD34⁺ 细胞增殖和分化来创建这些模型的过程。

Abstract

动物模型提供了 体外 和 体内 生物医学研究之间的重要转化。人源化小鼠模型为人类系统的表示提供了一座桥梁，从而可以更准确地研究发病机制、生物标志物和许多其他科学查询。在所描述的这种方法中，免疫缺陷型 NOD scid IL2Rγnull （NSG） 小鼠植入自体胸腺，注射肝源性 CD34 ⁺ 细胞，然后进行一系列注射细胞因子递送。与其他类似性质的模型相比，此处描述的模型通过基于 AAV8 或 pMV101 DNA 的载体编码的转基因递送细胞因子和生长因子，促进免疫细胞的改进重建。此外，它为重组小鼠提供长期稳定性，在 CD34⁺ 注射后的平均寿命为 30 周。通过这个模型，我们希望提供一种稳定且有效的方法来研究小鼠模型中的免疫疗法和人类疾病，从而证明对预测性临床前模型的需求。

Introduction

虽然动物模型使人们对细胞和分子系统有了更深入的了解，但挑战仍然存在于阐明物种特异性系统的复杂性，例如免疫、生理学和病理学的其他领域。非人灵长类动物 （NHP），如黑猩猩，历来被用来弥补模型研究中所需的空白;然而，NHP 模型可能非常昂贵且难以获得，特别是因为它们在欧洲¹ 已被禁止使用。

在成功的移植手术后，小鼠系统复制了人类免疫系统，如淋巴器官的重新繁殖所证明的那样。具有功能性人类免疫系统的小鼠的发育为在各种情况下对人类免疫力进行转化研究提供了机会。植入人类细胞和组织的免疫缺陷小鼠可以成功复制手术的人类免疫系统，有助于研究造血、免疫、基因治疗²、传染病³、癌症⁴ 和再生医学⁵。我们小组和我们的一些合作者已经使用该模型发表了结果，该模型展示了皮肤黑色素瘤⁶ 的临床前模型。该模型用途广泛，可应用于黑色素瘤和免疫疗法研究背景之外的无数领域。

外周血单核细胞 （PBMC） 通常用于人源化，因为它们导致 T 细胞的稳健重建，这些细胞在免疫耐受中已确立作用;然而，由于它们的自我更新率低且成熟谱系定型细胞的比率高，PBMC 经常被基于人干细胞 （HSC） 的产品所取代，这些产品可以来源于胎儿肝脏⁷。结合这些衍生的 HSC 产品，将人胸腺植入 NSG 小鼠的肾包膜下，可创建一个能够支持人 T 细胞发育的系统。这种模型被称为骨髓-肝脏-胸腺 （BLT），非常有利，因为它允许多系造血、自体胸腺中的 T 细胞教育和 HLA 限制性⁸。

本手稿中提出的模型是具有额外细胞因子递送的改良 BLT 模型。促炎细胞因子已被证明可以增强效应免疫细胞的能力，特别是通过基于 IL-15 的免疫疗法⁹。在人 CD34 ⁺ 细胞注射后约 8-12 周，在人源化小鼠 （胡 小鼠） 的外周血中观察到 CD45 ⁺ 淋巴细胞，与常规 NSG 小鼠的循环血液相比，显示重建明显增加。使用腺相关载体递送人 IL-3、IL-7 和 GM-CSF，与未接受细胞因子的小鼠相比，人 CD45⁺ 细胞在循环中的水平增加。添加 DNA 组合 II 细胞因子（SCF、FLT3、CKIT 和 THPO）可改善 T 细胞和髓系细胞分化¹⁰。添加细胞因子递送使该方法与其他 胡 小鼠模型区分开来，正如已发表的数据所支持的那样¹⁰。

该模型具有先天性和适应性人类免疫反应，其开发允许发表有关治疗耐药性和肿瘤微环境的数据¹⁰。前提是实验室可以访问组织样本以使用此方法;这种 胡 小鼠模型对于其他实验室研究类似领域以及扩展到免疫治疗和临床前研究的其他领域具有巨大潜力。

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Protocol

所有涉及使用动物的协议都受到 Wistar 研究所的机构动物护理和用户委员会 （IACUC） 的密切监控。该实验室遵守该委员会和主治兽医制定的指导方针，以确保相关动物的健康、安全和福祉。在遵循本协议之前，需要兽医和 IACUC 的批准，并且根据上述参与动物福利的各方的建议，与协议相比，个人在具体手术技术和动物处理方面可能会有所不同。

注:组织样品可以冷冻，直到准备好使用。此外，CD34 ⁺ 分离可以在肾移植手术的同一天或第二天进行。此信息将告知何时注射白消安:如果打算在隔离当天进行手术，则应先发制人地注射白消安以准备接收组织。用 30 mg/kg（100 μL，PBS 1x）新鲜制备的髓耗竭药物处理 30 只雌性 5-7 周龄 NSG 小鼠;白消安在手术前 24 小时注射 IP。

1. CD34⁺ 细胞分离

1. 通过将 100 mg 胶原酶/分散酶溶解在 50 mL RPMI1640中来制备消化溶液。使用 0.22 μm 真空过滤器对消化液进行消毒。
2. 胎肝（>20 周龄）以 50 mL RPMI1640 培养基提供。吸出并丢弃培养基，在含有肝脏的试管内留下 10 mL。
3. 在 50 mL 锥形管中用 45 mL RPMI1640 + 100 μg/mL 抗生素 Primocin 洗涤组织两次，在每次洗涤之间吸尘去除培养基。在吸尘介质之前，请务必让组织沉降到试管底部。
4. 将无菌组织筛放入 200 mL 无菌烧杯中。
5. 将胎肝倒入筛子中，并使用 10 mL 无菌塑料注射器的末端研磨组织。
6. 使用 50 mL RPMI1640 + 100 μg/mL 抗生素 PrimoCin 冲洗筛子中剩余的肝细胞，然后使用 50 mL RPMI1640 胶原酶/分散酶培养基 （2 mg/mL）。200 mL 烧杯现在包含带有 Primocin、RPMI1640 胶原酶/分散酶和匀浆肝脏的RPMI1640。
7. 将混合物分装到四个 50 mL 锥形管中，并在水浴 （37 °C） 中孵育 1 小时。每 15 分钟摇动一次锥形管。
8. 在四个 50 mL 锥形管中加入 15 mL Ficoll。
9. 小心地将匀浆的肝溶液放在上面，在每个试管之间分配大约 35 mL。请勿打扰界面。
10. 将试管放入离心机中，以 800 x g 的速度旋转 1 小时，同时以最小的加速/制动。
11. 从离心机中取出试管，将细胞从界面 （10-15 mL） 收集到两个 50 mL 锥形管中。
12. 加入 PBS 1x 至 50 mL 以洗涤沉淀，并以 300 x g 离心 5 分钟。丢弃上清液。
13. 将沉淀重悬于 10 mL ACK（氯化铵-钾）裂解缓冲液中，并孵育 5-10 分钟。用 1x PBS 填充管。
14. 使用台盼蓝和血细胞计数器在显微镜下手动计数细胞。将细胞以 300 x g 离心 5 分钟。
    注意:如果需要，可以从这里直接注射肝脏单核细胞，例如，如果细胞计数低于 5000 万个细胞。
15. 抽真空去除 PBS，并将细胞沉淀重悬于 300 μL 分离缓冲液（2 mM EDTA、5 μg/mL BSA 的 1x PBS 溶液）中，浓度为 100 x 10⁶ 个细胞或更少。对于超过 100 x 10⁶ 个单元格，使用基于上述单元格数量的比率来确定缓冲区的量（即，单元格加倍，缓冲液加倍）。
16. 加入 100 μL FcR 封闭试剂并孵育 2-5 分钟。
17. 加入 100 μL CD34 微珠抗体，充分混合并在冰上孵育 30 分钟;15 分钟后用手机械摇晃。
18. 加入 7-10 mL 分离缓冲液，并按顺序通过 100 μm、70 μm 和 40 μm 细胞过滤器过滤。
19. 将基于列的单元格分隔器放入磁性分隔器中。在分离器下方放置一根 15 mL 锥形管，以收集流出液和缓冲液。
20. 用 500 μL 分离缓冲液填充色谱柱。
21. 将细胞悬液倒入色谱柱中。
22. 用锥形管中收集的流出液和缓冲液填充色谱柱。
23. 用 500 μL 分离缓冲液洗涤色谱柱 3 次。
24. 丢弃流通液，用 15 mL 聚苯乙烯管替换管。
25. 用 1 mL 分离缓冲液填充色谱柱，从磁力架上取下色谱柱，然后一键冲洗柱塞。
26. 计数细胞并重悬于 1x PBS 中进行注射。放在冰上直到使用。

2. 胸腺加工

1. 加入 5-8 mL RPMI1640清洗自体胸腺（>20 周龄），让组织沉淀。通过真空小心地去除培养基，同时避免与胸腺接触。再重复一次。
2. 悬浮于 10 mL 室温RPMI1640中，加入 Primocin （100 μg/mL）。
3. 将胸腺转移到组织处理的培养皿中。确保胸腺完全涂有 Primocin 培养基。
4. 在室温下孵育 30-45 分钟。
5. 抽真空去除 Primocin 培养基。用 5-8 mL RPMI1640 洗涤胸腺，通过真空去除培养基，然后再次重复此作。
6. 将胸腺悬浮在 5-8 mL RPMI1640 中。
7. 通过使用两把手术刀切成 1 mm x 2 mm 的切片，准备孵育的胸腺以进行嫁接。
   注意:这将嫁接到小鼠体内;因此，确保胸腺切片可以相对容易地从注射器和连接的 22 G Hamilton 针头中吸进和吸出。

3. 肾下包膜移植和 CD34 细胞注射

1. 手术前检查小鼠的一般健康状况。剃掉鼠标的胡须，露出左侧身体上的一个区域（约 3 英寸 x 2 英寸）。
2. 在腔室中通过异氟醚 （诱导 5%，维持 2%-3%） 麻醉小鼠，然后将个体小鼠从腔室转移到带有鼻锥的手术阶段。
3. 用氯己定和酒精制备拭子对剃须区域进行消毒。通过捏合试验确保个体麻醉。
4. 在小鼠脊柱的后方做一个大切口（5-7 毫米），然后将皮肤向后折叠。
5. 确保此时脾脏在筋膜下方可见。在筋膜上做一个较小的 ~2 毫米切口。确保切口尽可能小，同时让肾脏完全暴露。
6. 确定这个切口的位置，目视识别脾脏并将其用作肾脏的标志物，这是不可见的。
   注意:鼠肾位于脾脏东北象限的一组脂肪后面。
7. 从这里开始，将手（外科医生）放在小鼠一侧与切口相对的位置，然后推动以露出肾脏。重新定位任何脂肪以完全暴露肾脏。
8. 用同一只手的手指稳定裸露的肾脏。如有必要，使用无菌 1x PBS 润滑暴露的肾脏。
   注意:需要注意的是，外科医生必须使用与处理鼠标侧面的手指不同的手指来握住肾脏以保持无菌。咨询研究所的兽医以正确维护无菌状态。
9. 同时，让助手准备一个装有胎儿胸腺组织的钝器注射器。用最少的介质轻轻吸取 2-3 个中等大小的胸腺块 （1 mm x 2 mm） 到针尖，然后将其交给外科医生进行手术。
   注意:胸腺块的数量取决于组织的大小，通常 2 块就足以获得人源化小鼠。
10. 让外科医生将针头穿过肾包膜的尾端，直到到达远端 （~2 mm），直到针头可见，但它不会突破肾包膜的颅侧。让助手插入注射器。
11. 将肾脏和任何暴露的脂肪放回腹膜中。放置一根可吸收缝合线（4 号）并用兽医粘合胶闭合浅表切口。
12. 术后，通过皮下注射 （1 mg/kg） 给予一剂镇痛药，25 μL 缓释丁丙诺啡 （1 mg/mL）。
13. 检查小鼠在手术后 5 分钟内是否开始恢复。
14. 在笼子之间，更换手套并在玻璃珠消毒器中对器械进行消毒。
15. 手术后 1-3 小时，通过静脉内 （IV） 注射将 100 μL 人 CD34 ⁺ 细胞（约 100,000 个细胞）注射到小鼠中。
16. 手术结束后（通常在第一个笼后 2 小时），然后 24 小时和 48 小时对小鼠进行一般健康检查。
17. 如果性情或生命体征有任何异常，请进一步监测小鼠。一旦他们通过了这些检查点，就不那么严格地监测老鼠（每周 2x-3 次）。
18. 手术后一周，向小鼠静脉注射 （IV） 100 μL AAV8 人细胞因子（IL-3、IL-7 和 GM-CSF;2 x 10⁹ 个基因组拷贝/mL）。
19. 手术后两周，进行质粒 DNA 组合 II 的 IM 注射。
    1. 使用电穿孔机进行质粒 DNA 组合 II:SCF、FLT3、CKIT 和 THPO 的 IM 注射。对于每只小鼠，混合 25 μL SCF （2 mg/mL）、25 μL THPO （2 mg/mL）、25 μL FLT3 （2 mg/mL） 和 25 μL CKIT （10 mg/mL）。
    2. 每个后腿进行一次注射，即总共两次，每条腿 50 μL，然后在每个注射部位进行电穿孔。

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Results

手术成功和术后适当注射后，可通过流式细胞术确认 CD34⁺ 分化。手术后约 8 周，对小鼠放血以准备 FACS，每 2 周重复一次，直到达到如前所述的人类免疫细胞的特定阈值¹⁰。简而言之，将 100 mL 血液收集在涂有锂和肝素的采血管中。使用 ACK 裂解缓冲液裂解红细胞后，用 FACS 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水、2% FBS 和 0.1% 叠氮化钠）洗涤细胞并离心。然后...

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Discussion

本手稿在此描述了通过在肾胶囊下移植人胎胸腺并随后注射 CD34⁺ 来生成人源化小鼠以重建人类免疫系统。

虽然该协议旨在创建最佳模型，但某些步骤对于可行性至关重要。例如，在 CD34⁺ 分离过程中，通过显微镜观察的人必须能够识别 CD34⁺ 细胞。虽然这似乎是多余的，但由于它们的形态，自动计数机并不总是能识别这些细胞?...

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysis buffer	Life Technologies Corporation
BD Microcontainer	BD		blood collection tubes
Busulfan	Sigma	B2635-25g	Irradiating drug; light sensitive
CD34 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
CKIT	Aldevron	custom	cytokine; stored at -20 °C
Collagenase/Dispase	Roche Diagnostics	11097113001	Stored at 4 °C
FcR Blocking reagent	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
Fetal tissue (liver and thymus)	Advanced Bioscience Resources		Delivered same day or overnight
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Stored at room temperature
FLT3	Aldevron	125964	cytokine; stored at -20 °C
Forceps	Various	Various
Hamilton syringe needle	Various	Various	22 G; 3 point; 2" length
Hemostats	Various	Various
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	magnetic separator
PBS	Gibco	14190-136	Stored at room temperature
Primocin	Invivogen	amt-pm1	antibiotic; stored at 4 °C
RPMI	Corning	10-040-CM	Stored at 4 °C
SCF	Aldevron	125962	cytokine; stored at -20 °C
Surgical scissors	Various	Various
THPO	Aldevron	125963	cytokine; stored at -20 °C
Tissue treated petri dish	Corning	430167
VetBond glue	3M	1469SB	glue
Visorb suture	Stoelting Co	5046	absorbable suture, size 4, 19 mm cutting