开发一种细胞共培养模型以模拟心脏缺血/体外再灌注

摘要

空间距离是评估分离内皮和心肌细胞层共培养模型中缺氧/再氧合损伤的关键参数，首次表明优化共培养空间环境对于为测试内皮细胞在心肌细胞保护中的作用提供有利的 体外 模型是必要的。

摘要

缺血性心脏病是全世界死亡和残疾的主要原因。再灌注可导致缺血以外的其他损伤。内皮细胞（EC）可以通过细胞间相互作用保护心肌细胞（CM）免受再灌注损伤。共培养可以帮助研究细胞 - 细胞相互作用的作用。混合共培养是最简单的方法，但由于分离处理和单细胞类型的下游分析不可行，因此受到限制。为了研究ECs是否可以以剂量依赖性方式衰减CM细胞损伤，以及是否可以通过改变两个细胞系之间的接触距离来进一步优化这种保护，我们使用小鼠原发冠状动脉内皮细胞和成年小鼠心肌细胞来测试三种类型的细胞培养插入物，其细胞间层距离在0.5， 分别为 1.0 毫米和 2.0 毫米。在仅CM中，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放评估的细胞损伤在缺氧期间和再氧合后显着增加，当距离为2.0 mm时，与0.5和1.0 mm相比。当EC和CM几乎直接接触（0.5 mm）时，缺氧后CM的再氧合损伤只有轻度衰减。当空间距离为1.0 mm时，这种衰减显着增加，当距离为2.0 mm时，EC在缺氧和缺氧/再氧合期间都减轻了CM损伤，表明ECs需要足够的培养距离才能与CM串扰，以便分泌的信号分子可以循环并充分刺激保护途径。我们的研究结果首次表明，优化EC/CM共培养空间环境对于测试EC在模拟缺血/再灌注损伤CM保护中的作用提供了有利的 体外 模型。本报告的目标是为调查人员提供一种循序渐进的方法，以利用这一重要模型来发挥自己的优势。

引言

缺血性心脏病是全世界死亡和残疾的主要原因^1，2。然而，再灌注的治疗过程本身可引起心肌细胞死亡，称为心肌缺血/再灌注（IR）损伤，对此仍然没有有效的补救措施³。内皮细胞（EC）已被建议通过分泌旁分泌以及细胞间相互作用来保护心肌细胞（CMs^{） 4}。

细胞共培养模型已被广泛用于研究自分泌和/或旁分泌细胞 - 细胞相互作用对细胞功能和分化的作用。在共培养模型中，混合共培养是最简单的，其中两种不同类型的细胞以所需的细胞比⁵在单个培养室内直接接触。然而，鉴于混合群体，细胞类型之间的单独处理和单细胞类型的下游分析并不容易实现。

先前的研究表明，缺氧和缺血性损伤对细胞膜的完整性造成显着损害，通过乳酸脱氢酶（LDH）的释放来测量。这种损伤在复氧时加重，类似于再灌注损伤^6，7，8。当前方案的目标是测试假设，即EC的存在可以剂量依赖性地衰减由缺氧和再氧合（HR）引起的CM的细胞膜泄漏，并且可以通过改变两个细胞系之间的接触距离来优化EC的保护作用。因此，我们采用了三种类型的细胞培养插入物和小鼠原发性冠状动脉内皮细胞和成年小鼠心肌细胞。这些由康宁、默克密理博和格瑞纳Bio-One品牌设计的插入物使我们能够创建三种不同的细胞培养串扰条件，细胞间距离分别为0.5、1.0和2.0 mm。在每种情况下，每个刀片镀100，000个EC。

此外，为了确定共培养中ECs的密度是否有助于该模型中的HR损伤衰减，我们研究了EC浓度与CM释放LDH之间的剂量 - 反应关系。

本报告为调查人员提供了一种循序渐进的方法，使他们能够利用这一重要模型。

研究方案

1. 实验准备/电镀

1. 根据制造商的说明维护CM和EC。
   1. 当两个细胞系从供应商处到达时，解冻它们。用新鲜培养基洗涤后，将板放入T25烧瓶中。建议从购买细胞的同一供应商处购买每种细胞培养基。第二天，用培养基刷新细胞，并在汇合时使用。
   2. 将细胞培养箱保持在37°C，21%O₂，5%CO₂，74%N₂ 并保持加湿。
      注意:从C57BL / 6小鼠的冠状动脉中分离出用于该方案的小鼠原发性冠状动脉内皮细胞，并且从成年C57BL / 6J小鼠心脏中分离成年小鼠心肌细胞并商业化获得（参见 材料表）。
2. 在无菌条件下将CM板CM板放到24孔板（下层）的底部。24小时后，将ECs板放入共培养孔的插入物（或上部）中。EC电镀后24小时，将EC插入物置于CM板底座上，开始共培养期。使用前让细胞共培养至少12-24小时。下面详细介绍了这些步骤。
   1. 在光学显微镜下估计CM细胞系汇合度。当细胞在培养瓶中似乎有90%-100%融合时，继续进行实验接种。
   2. 从含有融合细胞培养物的烧瓶中取出培养基，并用3-5 mL胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）对T25烧瓶进行胰蛋白酶消化。轻轻搅拌烧瓶，在37°C下孵育2-5分钟，然后在光学显微镜下评估酶促进展。一旦细胞开始四舍五入，使用细胞刮刀将细胞从表面上分离。
   3. 分离后，通过将胰蛋白酶/细胞溶液加入含有10 mL培养基的50 mL管中以灭活胰蛋白酶溶液，用于T25烧瓶。将细胞悬浮液以120× g 离心2分钟，得到软细胞沉淀。除去上清液并将沉淀重悬于5mL培养基中。
   4. 为了进行细胞计数并确认细胞活力，混合10μL重悬细胞的等分试样和10μL台盼蓝染料。使用细胞计数器计数活细胞。用新鲜的常规培养基稀释细胞，以达到所需的接种密度。根据所需的种子密度和储备溶液的细胞浓度计算体积。所有电镀均应在无菌条件下进行。
   5. 将CM以每孔300，000的接种密度将CM板固定在预先包被细胞外基质的24孔板的底部。将细胞保持在37°C，用21%O_2和 5%CO₂ 过夜。
   6. 24小时后，将ECs板放入刀片中，每个刀片的最佳电镀密度为100，000（培养面积为33.6 mm²），（图1）。EC电镀24小时后，将EC插入CM孔内，开始共培养。在进行实验之前，让细胞共培养12-24小时。
   7. 确保在进行实验时，CM和EC的汇合度均达到80%-90%。

2. 缺氧/再氧合模拟缺血/再灌注损伤 体外

注意:需要按照所述执行以下步骤，不要在两者之间暂停。

1. 通过将〜25 mL培养基倒入50 mL锥形管中来制备缺氧培养基。用硅胶膜对顶部进行空气密封，并使用灭菌移液器打孔。创建另一个孔，这次将移液器浸入培养基中约2/3。
2. 用缺氧气体（0.0125%O₂，5%CO₂，94.99%N₂）以30 L / min的流速冲洗培养基5分钟。当缺氧开始时，这最大限度地减少_了溶解在 培养基中的O 2（步骤2.5）。
3. 丢弃含有附着细胞的24孔板或培养插入物的培养基，并用100μL /孔的10%磷酸盐缓冲盐水（PBS）非常温和地洗涤。然后，将500μL新鲜制备的缺氧培养基加入到板或插入物的每个孔中。
   注意:在步骤2.5开始细胞和培养基的真正缺氧之前，培养基中的缺氧在此步骤中尽可能短暂地中断。
   1. 在常氧对照组中，用含有葡萄糖和血清的新鲜正常培养基替换原始培养基。
4. 通过在腔室内放置装满无菌水的培养皿来加湿缺氧室。接下来，将包含缺氧基团的板放入腔室中。
5. 用缺氧气体（0.0125%O₂，5%CO₂，94.99%N₂）以30 L / min的流量冲洗缺氧室5分钟。将室置于37°C培养箱中24小时。
6. 缺氧后，在正常条件下培养CM和EC。为此，丢弃板/插入片段的旧培养基，用正常培养基（含有葡萄糖和血清;每个孔/插入片段的500μL）替换它，并在正常培养条件下将其储存在培养箱中（21%O₂，5%CO₂，74%N₂，37°C）2小时以模拟再灌注。
7. 为了控制培养基置换的任何影响，请在改变缺氧培养基的同时更换常氧细胞的培养基。
   注: 图2 提供了该协议的原理图概述。

3. 终点评估

1. 将细胞培养基从24孔板转移到96孔板中。使用来自24孔板的每个孔的200μL培养基，并相应地均匀分布到96孔板的四个孔中。对于正常氧、缺氧和心率，各使用一个板。
2. 确定细胞损伤的程度，例如，按照制造商的说明，使用细胞毒性测定试剂盒测量LDH的吸光度。按照测定方案中的指示在96孔板中进行测定。

4. 统计

1. 将参数数据显示为平均值/标准差，将非参数数据显示为具有中值/四分位距的箱形图。应执行充分的参数与非参数多重比较测试，并使用可接受的事后测试来降低 1 型错误的机会。显著性通常设置为 alpha 0.05（双尾）。
2. 对于当前研究中进行的所有实验，在一个实验中至少进行三次井重复。用于统计分析的每个实验有三到六次重复。

结果

本实验中使用的所有三种类型的插入物（A，B，C）具有相同的0.4μm孔径。它们之间的唯一区别是插入物到碱基的高度，这使得两个共培养的细胞层之间的距离分别为0.5，1.0和2.0 mm（图3），并且它们来自不同的供应商（有关详细信息，请参阅 材料表）。

为了建立一种 体外 共培养模型，其中两个细胞系的单独层经历HR以模拟IR损伤，我?...

讨论

协议中的关键步骤
细胞共培养模型已被用于研究心脏保护的细胞机制。因此，如何创建两个独立的层，它们之间有有意义的距离，对于开发合适的共培养模型至关重要。研究模拟IR（即HR损伤）的一个挑战是，不仅缺血（缺氧）本身，而且再灌注（再氧合）也会加重细胞功能障碍。因此，一个现实的模型需要反映这些特征，例如，证明缺氧后再氧合的损伤充分增加，而不是单独缺氧...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested