使用多重 原位 杂交检测小鼠迷走神经传入神经元中G蛋白偶联受体表达

摘要

采用多重 原位 杂交（ISH）来同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合物中两个G蛋白偶联受体和一个转录因子的转录物。该协议可用于生成迷走神经传入神经元转录谱的准确图谱。

摘要

本研究描述了小鼠颈静脉结节多重 原位 杂交（ISH）的方案，特别强调检测G蛋白偶联受体（GPCRs）的表达。使用RNAscope技术处理福尔马林固定的颈静脉结节，以同时检测两个代表性GPCR（胆囊收缩素和ghrelin受体）的表达，并结合一个标记基因的结节（成对的同源盒2b，Phox2b）或颈静脉传入神经元（PR结构域锌指蛋白12，Prdm12）。使用共聚焦显微镜对标记的神经节进行成像，以确定上述转录本的分布和表达模式。简而言之，发现Phox2b传入神经元大量表达胆囊收缩素受体（Cck1r），但不是ghrelin受体（Ghsr）。还发现了Prdm12传入神经元的一小部分来表达Ghsr和/或Cck1r.讨论了多重ISH的设计，处理和解释中潜在的技术警告。本文中描述的方法可能有助于科学家生成迷走神经传入神经元转录谱的准确图谱。

引言

迷走神经传入者的细胞体包含在颈静脉，岩质和结节^1，2，3中。它们的轴突通过迷走神经的几个分支一起传播到颅颈，胸部和腹部区域^{4，5，6，7。}从它们的内脏末端，迷走神经传入物可以对广泛的生理和有害刺激做出反应^{8，9，10。}然而，参与迷走神经传感的信号分子和受体的分布仍然很差。这部分是因为迷走神经节尽管体积小，但表达的受体范围很广，包括大量的GPCR8，11，12，13。此外，迷走神经传入神经元本质上是异质的，并且显示出不同的分子谱

研究方案

注意：本研究中使用的小鼠是纯C57BL / 6J背景上的野生型雄性。总共使用4只小鼠进行多重ISH。所有小鼠在牺牲时大约8周大。一只雄性小鼠（约一岁）也用于证明与衰老相关的内源性荧光。动物被关在屏障设施内的通风笼子里 ，可以随意 获取食物和水。UT西南医学中心机构动物护理和使用委员会审查并批准了下述程序。有关试剂和工具的详细信息，请参见 材料表。

1. 样品采集

1. 在牺牲当天，向小鼠施用过量的水合氯醛（500mg / kg，ip）。使用蠕动泵将深度麻醉的小鼠经心电泳和5 mL的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温下灌注50 mL的10%福尔马林。
   注意：这是在通风橱中完成的，以防止吸入福尔马林。
2. 当结节，岩和颈神经节融合在小鼠¹⁵中形成单个神经节性团块时，在解剖镜和细弹簧剪刀和镊子的帮助下，小心地从每侧（左右）收集整个迷走神经节团团（见 材料表）。
3. 当用一把大剪刀斩首小鼠时（见 材料表），避免压碎脑干。
4. 按照前面在大鼠⁴⁰中描述的解剖方法，用小镊子（材料表）去除气管外侧的胸骨和舌骨肌肉，以暴露枕骨。清除整个肌肉、脂肪组织和结膜组织区域，直到颈动脉、迷....

结果

虽然RNAScope可以应用于任何年龄，性别或遗传背景的动物，但建议与年轻人（<3个月大）一起工作。这是因为荧光伪影（例如，脂褐素）是老年动物神经元中的常见发现⁴¹。来自老年小鼠的福尔马林固定神经节通常含有令人惊讶的强烈内源性荧光，很容易被误认为是真正的染色（图1A，B）。在任何情况下，建议在处理之前验证组织中内源性荧光?.......

讨论

ISH的技术是在20世纪60年代后期发明的^42。然而，直到20世纪80年代中期，它才被应用于中枢和周围神经系统中mRNA的检测^43，44。考虑到神经系统的异质性和抗体反复出现的问题，在细胞水平上定位特定的转录本仍然是一个非常宝贵的工具。尽管如此，传统的ISH方法仍然费力且异常敏感。幸运的是，这项研究采用了一种称为RNAscope的高灵敏.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Fisher Scientific	BP399-4
20x SSC	Invitrogen	AM9763
-80°C freezer	PHCBI	MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021	Adobe		photo and design software
Baking oven	Thermo Scientific	Model:658
Confocal microscope	Zeiss	LSM880 Airyscan
Cover glass	Brain Research Laboratories	2460-1.5D
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Dumont #5 Forceps	F.S.T.	11252-20
Ecomount	Biocare Medical	EM 897L	mounting medium
HybEZ oven			hybridization oven
Hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
ImageJ-Fiji	NIH
Large scissors	Henry Schein	100-7561
Micro centrifuge tubes	VWR	20170-333
Minipump variable flow	Fisher Scientific	13-876-1
Opal 520	Akoya biosciences	FP1 1487001KT	Fluorescent biomarker
Opal 570	Akoya biosciences	FP1 1488001KT	Fluorescent biomarker
Opal 690	Akoya biosciences	FP1 1497001KT	Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant			mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2	ACD /Bio-Techne	323100	multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3	ACD /Bio-Techne	313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB	ACD /Bio-Techne	310043
RNAscope probe Mouse Ghsr	ACD /Bio-Techne	426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2	ACD /Bio-Techne	407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2	ACD /Bio-Techne	524371-C2
RnaseZap	Sigma	R2020	Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors	Millipore Sigma	Z265977
Superfrost Plus slides	Fisherbrand	1255015
Tissue Tek OCT medium	Sakura	4583
User manual	ACD	323100 USM
Vannas Spring Scissors	Roboz	RS 5620
ZEN Imaging Software	Zeiss