基于人类原发性皮肤成纤维细胞的亨廷顿舞蹈症模型微管加端动力学可视化

摘要

该协议专门用于通过EB3蛋白转染进行微管加端可视化，以研究它们在原代细胞培养物中的动态特性。该协议是在从亨廷顿舞蹈症患者获得的人类原发性皮肤成纤维细胞上实施的。

摘要

用荧光标记的感兴趣标记蛋白转染并结合延时视频显微镜是研究细胞骨架动态特性的经典方法。该协议为人原发性成纤维细胞转染提供了一种技术，由于原代细胞培养条件的特殊性，这可能很困难。此外，细胞骨架动态性能维持需要低水平的转染才能获得良好的信噪比，而不会导致微管稳定。重要的是要采取措施保护细胞免受光诱导的应激和荧光染料褪色的影响。在我们的工作过程中，我们测试了不同的转染方法和方案以及不同的载体，以选择适合人类原发性成纤维细胞研究的最佳条件组合。我们分析了生成的延时视频，并使用ImageJ计算了微管动力学。微管在不同细胞部分的正端动力学并不相似，因此我们将分析分为亚组 - 中心体区域，薄片和成纤维细胞的尾部。值得注意的是，该协议可用于患者样本中细胞骨架动力学的 体外 分析，从而为了解各种疾病发展的动力学迈出了下一步。

引言

亨廷顿舞蹈症（HD）是一种无法治愈的神经退行性病理学，由编码亨廷顿蛋白（HTT）的基因突变引起。HTT主要与囊泡和微管有关，可能参与微管依赖性转运过程^1，2。为了研究突变HTT对微管动力学的影响，我们使用EB3蛋白的体外可视化，通过结合和稳定生长的正端来调节微管的动态特性。为了将荧光标记的EB3加载到人皮肤成纤维细胞中，应用质粒转染。在本研究中，我们使用从HD患者皮肤活检中获得的原发性成纤维细胞培养物。

HTT蛋白基因的突变导致聚谷氨酰胺束³的伸长。HTT在细胞内吞作用4、细胞转运^1、2、蛋白质降解⁵等细胞过程中起作用。这些过程的很大一部分涉及细胞骨架的各种元件，包括微管。

人类原代细胞是尽可能密切地再现患者细胞中发生的事件的最佳模型。要创建这样的模型，需要从人体活检材料（例如，从手术样本中）分离细胞。所得原代细胞系适合于使用各种遗传、生化、分子和细胞生物学方法研究发病机制。此外，人类原代细胞培养物可作为创建各种转分和转基因培养物^{的前体6。}

然而，与永生化细胞培养物相比，原代细胞的显着缺点是其传代能力有限。因此，我们建议在早期传代阶段（最多15个）使用细胞。较老的文化退化得非常快，失去了它们独特的属性。因此，新获得的原代细胞应保持冷冻以长期储存。

原代细胞培养物易受培养条件的影响。因此，它们通常需要独特的方法和生长条件的优化。特别是，我们实验中使用的人体皮肤原发性成纤维细胞对底物的要求很高。因此，我们根据实验类型使用了各种附加涂层（例如明胶或纤连蛋白）。

细胞细胞骨架决定了细胞的形状、迁移率和运动。细胞骨架的动力学对于相间和有丝分裂中的许多细胞内过程至关重要。特别是，由微管蛋白聚合的细胞骨架是高度动态和极性的结构，能够使运动蛋白介导的定向细胞内转运。微管的末端处于不断的重排中，它们的组装阶段与拆卸阶段交替，这种行为被称为"动态不稳定性^{"7，8，9。}各种相关蛋白质改变了聚合反应的平衡，导致聚合物形成或蛋白质单体形成。微管蛋白亚基的添加主要发生在微管¹⁰的正端 。终结合（EB）蛋白家族由三个成员组成:EB1，EB2和EB3。它们充当加端跟踪蛋白（+TIPs），并通过结合和稳定其生长的正端来调节微管的动态特性^11。

许多研究使用荧光分子标记的微管蛋白显微注射或转染以及延时成像和视频分析，以 在体外可视化微管 。这些方法可能是侵入性的，对细胞有害，尤其是原代人类细胞。最具挑战性的步骤是找到细胞转染的条件。我们试图在不影响活力和天然细胞形态的情况下达到尽可能高的转染水平。本研究应用经典方法研究健康供体和亨廷顿舞蹈症患者皮肤成纤维细胞微管动力学的差异。

研究方案

该协议遵循2015年9月8日联邦医学生物局物理化学医学研究和临床中心的指南。

注: 图 1 概述了该协议。

1. 获得人皮肤成纤维细胞的初级培养物（图2）

1. 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）培养基中，补充50μg/ mL青霉素和50 U / mL链霉素，在几个小时内将活检送至实验室。
   注意:在患者签署知情同意书后，医生必须在无菌条件下进行皮肤活检。
2. 将活检组织与少量培养基一起放入6厘米培养皿中。
3. 使用无菌手术刀，将活检样本切成约0.5-1毫米大小的碎片。将1-2个获得的片段放入3.5cm培养皿中，并在活检片上放置无菌盖玻片。缓慢加入1.5mL生长培养基到以下组合物中:DMEM，50 U / mL青霉素链霉素和10%胎牛血清（FBS）。
4. 在CO₂培养箱内的生长培养基中培养成纤维细胞，保持在5%CO 2，37°C，80%湿度。
   注意:4-7天后，首先是角质形成细胞，然后是成纤维细胞，开始从组织迁移到培养皿的底部。

2. 初级培养物的储存、冷冻和解冻

1. 从培养皿中取出细胞（见第3.2-3.4点）。
2. 将细胞悬浮液转移到15mL锥形管中，并在200×g下离心5分钟。 然后弃去上清液并将细胞沉淀重悬于900μL冷却的FBS中。
3. 一滴一滴地转移到冷冻保存管中，加入100μL二甲基亚砜（DMSO）。
4. 将冷冻探头置于-80°C的低温冰箱中。 二十四小时后，将冷冻管转移到液氮（-196°C）中长期储存。
5. 为了解冻冷冻保存的细胞，从氮气储存中除去冷冻液，并在1分钟内将1mL内容物转移到含有9mL转运介质的15mL锥形管中，预热至37°C。
6. 小心地重悬，然后在200×g下离心管5分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于所需体积的生长培养基中，并将它们放在所需直径的培养皿上。

3. 细胞培养

1. 用蒸馏水中制备的高压灭菌的0.1%明胶溶液盖住盘子底部。孵育15分钟。
   注意:对于转染可视化，应使用玻璃底板皿（玻璃厚度为170μm的共聚焦培养皿）。
2. 制备具有以下组成的培养基:补充有10%FBS，2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，50 U / mL青霉素链霉素的DMEM。充分混合并储存在4°C。 在加入细胞之前，将培养基加热至37°C。
3. 在显微镜下评估培养物。取出培养基并用Dulbecco的磷酸盐溶液（DPBS）洗涤成纤维细胞。
4. 向细胞中加入1mL预热的0.25%胰蛋白酶溶液。在显微镜下检查细胞是否完全脱离底物。用1mL培养基使胰蛋白酶失活。
5. 将细胞悬浮液转移到15mL锥形管中。将管以200×g离心5分钟，除去上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL培养基中。
6. 计算单元格的数量。计算所需的细胞数量，以8-15 x 10³/ cm² 的密度接种它们，并重悬于2mL培养基中。
7. 从培养皿中取出明胶溶液，并立即加入2mL细胞悬浮液。在CO₂ 培养箱中在37°C培养成纤维细胞。
8. 每 2-4 天刷新一次培养基。
   注意:对于实验，使用4-11个传代的细胞。

4. 转染

1. 转染前24小时用新鲜培养基替换培养基。
   注意:细胞汇合度应为70-80%。
2. 根据细胞接种的面积和密度制备DNA-脂质复合物。使用脂质体基转染剂。
   注意:使用细胞接种密度为1 x 10⁴个细胞/ cm^2。
3. 将3μL商业转染试剂加入125μL不含任何抗生素的最佳最小必需培养基（Opti-MEM）中，而不接触管壁。轻轻重悬。
4. 通过将1μg质粒DNA加入125μLOpti-MEM来稀释质粒DNA（GFP-EB3）。轻轻重悬。
   注:编码GFP-EB3¹¹的表达载体是I. Kaverina博士（纳什维尔范德比尔特大学）在A. Akhmanova博士（鹿特丹伊拉斯谟大学）的许可下收到的实物礼物^11。
5. 将稀释的质粒DNA加入每管稀释的转染试剂（1:1）。孵育30分钟。
6. 将DNA-脂质复合物加入含有细胞的6厘米培养皿中，并与十字形摆动混合30秒。用转染剂孵育细胞24小时，然后换成新鲜培养基。分析24 h和48 h后转染效率。
   注:转染后24 h，效率为10-15%，48 h后可达40%。

5. 准备成像

1. 在细胞活体成像之前，将培养基更换为没有pH指示剂染料的培养基，以减少自发荧光。
2. 小心地将矿物油涂在介质表面以完全覆盖介质，将其与外部环境隔离，以减少_O2 渗透和介质蒸发。
3. 使用汞灯和具有高数字光圈的60倍或100倍物镜进行油浸拍摄图像。
   注意:对于 体内 观察，显微镜必须配备培养箱以保持细胞的必要条件，包括将物体台和透镜加热至+37°C，具有CO₂ 供应的封闭室以及湿度水平支持。使用双蒸馏水来产生湿度。拍摄前检查双蒸馏水的液位。
4. 在成像之前，将共聚焦培养皿与细胞一起置于显微镜支架中。确保碟形天线和相机牢固地固定在支架上，以避免在拍照时漂移。

6. 设置成像参数

1. 选择低曝光值，因为光会诱发破坏细胞的活性氧（ROS）。
   注意:为了研究人皮肤成纤维细胞中微管的动力学，选择了300 ms的暴露。
2. 专注于感兴趣的对象。
   注:对于长期延时成像，请使用自动对焦稳定系统来补偿沿z轴可能偏移的情况。
3. 根据细胞的光敏性和荧光染料褪色的速率选择最佳成像条件。
   注意:由于微管是高度动态的结构，因此可以选择相当短的时间间隔，并且帧速率必须足够高。为了研究皮肤成纤维细胞中的微管动力学，我们以1帧/秒的频率使用3-5分钟。
4. 选择下一个对象获取图像时，请远离已成像区域。由于这个区域受到光线的影响，因此会出现明显的光漂白。
   注:由于使用了相对较高的成像频率，因此快门在图像之间没有关闭，并且灯在整个成像期间都亮起，这就是褪色增加的原因。
5. 选择最佳视频，以直观地研究微管的动力学，同时考虑转染的质量，微管图像的质量（最佳信噪比）以及分析细胞时没有漂移（图3）。
6. 使用选定的视频，通过在ImageJ或Fiji程序中跟踪微管的加端动力学来研究它们（图4）。
   注:有关定量分析说明，请参见补充图2和补充文件1。

结果

使用该协议产生的GFP-EB3电影（图1）说明了微管的动态特性。微管参与不同的细胞过程，它们的动态特性影响来自患者活检材料的原代人细胞培养物的各种生命特征（图2）。

以下参数决定了微管的动态不稳定性:生长速率（聚合）和收缩速率（解聚）;灾难的频率（从聚合到解聚的转变）;救援的频率（从解聚到聚合的过渡）;以及停?...

讨论

从高质量的显微图像中可以获得更高质量的微管动力学分析结果。重要的是要观察活细胞延时成像的所有必要条件，并正确调整成像参数。使用带有玻璃底的特殊细胞培养皿（共聚焦培养皿）很重要，因为玻璃具有与塑料不同的光折射率。玻璃的厚度及其在整个区域内的均匀性也非常重要，因为这些参数对于正常的样品聚焦至关重要。违反这些参数不可避免地会导致完美对焦系统故障，从而导致?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD	Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte	Logos Biosystems	L40002
Microscope incubator for lifetime filming	Okolab	Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
		Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)	Open source image processing software
NIS Elements	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil)	MP	151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish	SPL Lifesciences	20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm)	SPL Lifesciences	211350	Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube	SPL Lifesciences	50015
Cryogenic Vials	Corning-Costar	430659
Microcentrifuge Tube	Nest	615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Dimethyl sulfoxide	PanEko	135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	PanEko	C420
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution)	PanEko	P060
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin)	PanEko	070
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax	Gibco	519850026
Penicillin-streptomycin	PanEko	A063
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP	Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]	Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003