多光子活体成像用于监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中白细胞募集

摘要

白细胞和血小板的募集是动脉生成过程中侧支动脉有效生长所必需的基本组成部分。多光子显微镜是一种有效的工具，用于跟踪体内 高 时空分辨率和较少光毒性的细胞动力学，以研究动脉生成过程中的白细胞募集和外渗。

摘要

动脉生成在很大程度上取决于白细胞和血小板募集到生长中的侧支血管的血管周围空间。在动脉生成中分析侧支动脉和白细胞的标准方法是 离体 （免疫）组织学方法。然而，这种技术不允许测量动态过程，如血流、剪切应力、细胞间相互作用和粒子速度。本文提出了一种利用活体成像监测动脉生成过程中生长侧支动脉 体内过程的方案 。这里描述的方法是一种可靠的动力学测量工具，并通过多光子激发显微镜提供具有最小光细胞毒性的高对比度分析。在分析生长的侧支动脉之前，通过股动脉的单侧结扎在小鼠的内收肌中诱导动脉生成。

结扎后，由于剪切应力增加，先前存在的侧支动脉开始生长。手术后24小时，切除侧支动脉上方的皮肤和皮下脂肪，构建一个用于进一步分析的口袋。为了在体内成像过程中可视化血流和免疫细胞，通过放置在小鼠尾静脉中的导管静脉注射CD41-异硫氰酸荧光素（FITC）（血小板）和CD45-藻红蛋白（PE）（白细胞）抗体。本文介绍了活体多光子成像作为常用的静态离体（免疫）组织学分析的替代或体内补充，以研究与动脉生成相关的过程。综上所述，本文描述了一种新颖而动态的体内方法，用于研究动脉生成的后肢模型中的免疫细胞运输、血流和剪切应力，这显着增强了评估的可能性。

引言

尽管近年来对研究兴趣浓厚，但心血管疾病，如缺血性心脏病和中风，仍然是全球主要死因¹。目前这些疾病的治疗方法是高侵入性疗法，例如经皮腔内血管成形术、经皮腔内冠状动脉成形术或搭桥手术²。因此，迫切需要开发替代的、非侵入性的治疗方案。身体可以在狭窄或闭塞的血管周围建立自然旁路，将中断的血流重定向到狭窄的远端。这个过程称为动脉生成²。最近的许多研究表明，增加的流体剪切会影响白细胞募集，这在动脉生成过程中起着重要作用³。目前分析动脉生成过程中白细胞募集的主要选择是 离体 （免疫）组织学分析或荧光激活细胞分选（FACS）方法⁴。为了能够评估动脉生成过程中的白细胞动力学，本文提出了一种使用多光子显微镜的活体成像方案。

白细胞是动脉生成过程中募集的主要血细胞^3。该协议使用多光子成像来显示侧支动脉中用注射的抗CD45-PE抗体标记的贴壁白细胞的爬行，在通过股动脉结扎术（FAL）诱导动脉生成24小时后使用小鼠后肢缺血模型^5，6。或者，免疫细胞可以被标记在离体并小心地注射到小鼠体内，如使用活体^显微镜的血管生成研究所示7。血管和动脉内的血流可以通过CD41-FITC（标记血小板），葡聚糖-FITC（血浆）或通过二次谐波产生（SHG）可视化，后者可视化存在于维管树某些部分的基底膜中的1型胶原蛋白。SHG是多光子激发的独特自由标记效应。多光子成像允许长期细胞跟踪，而不会伤害组织并通过激光功率激发激活细胞。多光子显微镜是可视化活体动物中荧光标记细胞和结构的首选成像方法，因为它能够以最小的光毒性将荧光团激发到组织/器官更深处^8。

使用在飞秒间隔内传输脉冲的调谐红外激光器仅在焦平面上激发荧光染料，在焦平面上方和下方没有激发⁸。因此，多光子显微镜允许高时空分辨率，更少的光损伤，并增加组织渗透成像，以研究器官内的动态生物事件。它是活体动物成像的理想显微镜工具。然而，多光子和任何其他活体显微镜技术由于心跳、呼吸、蠕动运动、肌肉张力和其他生理功能而受到组织运动的限制，这会干扰成像采集和分析。由于这些移动会损害时间和空间分辨率，有时甚至禁止后续分析，因此必须适当处理它们，以便能够进行准确的数据分析和解释。已经开发了几种策略来降低或防止组织运动引起的伪影。该协议应用称为VivoFollow⁹的原位漂移校正软件来校正图像采集过程中的组织漂移。这种方法提供了所需的图像稳定，可实现长期成像和细胞跟踪分析。

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研究方案

这项研究得到了巴伐利亚动物护理和使用委员会的批准（由道德规范批准:ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99）;这些实验严格按照德国动物立法指南进行。

1. 动物和股动脉结扎术

注意:为了诱导无菌炎症和动脉生成，使用8-10周龄雄性C57BL / 6J小鼠。在FAL或假手术期间或之后，没有一只小鼠死亡或遭受伤口感染或伤口愈合障碍。

1. 麻醉
   注意:在注射MMF混合麻醉剂之前，建议首先用5%异氟醚麻醉，直到小鼠睡觉。
   1. 称量小鼠并制备剂量为咪达唑仑5.0mg / kg，美托咪定0.5mg / kg和芬太尼0.05mg / kg的MMF混合物。
   2. 用 MMF 混合物填充 1 mL 注射器，并使用 30 G 针头（用 5% 异氟醚麻醉后）注射 100 μL sc. 的最终体积。
   3. 将鼠标放在温暖的垫子上，等待鼠标完全麻醉。将计时器设置为 35 分钟。在此之后，注射皮下一半剂量（50μL）的MMF混合物。
   4. 通过测试鼠标的踏板和指间反射（通过用力捏住脚趾）来检查麻醉深度。
      注意:无反应表明镇痛深度足够。
2. 股动脉结扎术
   注意:使用无菌手术器械和缝合线。开封前和闭合后用消毒剂对皮肤进行消毒。
   1. 将麻醉的小鼠放在加热板（35-37°C）上以维持生理体温。在每只眼睛上涂抹眼霜（泛醇），以防止麻醉下眼睛干燥。
   2. 在FAL之前和之后将麻醉小鼠转移到激光多普勒成像（LDI）室以检查血流和灌注（图1A-C）。
   3. 去除毛发，对皮肤进行消毒，然后切开以进入股动脉。在手术显微镜下，使用编织丝线（7-0）结扎小鼠后肢的右股动脉，并对左股动脉进行假手术，以作为^{先前描述的内部}对照6（图1D-K）。
      注意:皮肤上的切口是用小剪刀做的，以避免直接伤害靠近皮肤的血管。
   4. 使用编织丝线缝合皮肤（6-0）。每12小时给予丁丙诺啡（0.1mg / kg）皮下，在拮抗麻醉以缓解疼痛之前10分钟开始。观察动物的疼痛信号，即手术后24小时梳理活动减少，不愿移动或驼背姿势。
   5. 注射（皮下）纳洛酮（1.2 mg / kg），氟马西尼（0.5mg / kg）和阿替美唑（2.5mg / kg）的组合，以在完成FAL并闭合皮肤后拮抗麻醉。
   6. 手术后，将鼠标放在温暖的垫上并持续监测动物，直到它可以保持直立姿势并开始在笼子周围正常行走。
   7. 当小鼠完全清醒时，将其与其他小鼠一起放回笼子里，然后将笼子放回动物宿舍。

2. 多光子活体成像的组织制备

1. 尾静脉注射
   注意:在开始准备活体成像之前，动物需要处于麻醉状态。在引入静脉导管针头之前，建议在尾部涂抹皮肤消毒剂。这也将有助于可视化船只。
   1. 使用2 x 30 G针头，10 cm细孔聚乙烯管（0.28 mm内径和0.61 mm外径），1 mL注射器和组织丙烯酸胶准备尾静脉注射导管，以将导管固定在小鼠尾巴上，以便在成像期间进一步静脉注射（图2A，B 和 图2F）。
   2. 制备用于静脉注射的抗体溶液:CD45-PE和CD41-FITC（20μg/小鼠），最终体积为100μL。
   3. 检查尾部是否有侧向定位的尾静脉，并筑坝静脉以识别尾静脉。对尾部进行消毒，插入静脉导管，并使用组织组织丙烯酸胶固定（图2B）。
   4. 在成像前（至少15分钟前）和完成组织制备后注射抗体。
2. 组织制备
   注意:在组织制备之前，始终使用温暖的垫子并在每只眼睛中滴一滴眼霜（泛醇）。使用无菌手术器械和缝合线。打开前和关闭后用消毒剂对皮肤进行消毒。
   1. 将麻醉的鼠标放在稳定且便携的垫上。使用胶带将鼠标固定在仰卧位置，将鼠标固定在垫子上（图2B）。
   2. 模制两块造型粘土，并将这些块放置在鼠标的上后肢下方，以确保内收肌的平面位置（图2B，由红色箭头表示）。
   3. 为确保鼠标的稳定体温为37°C，请将鼠标垫放在手术显微镜下的加热板上，放大0.64-4.0倍（图1L）。
   4. 去除双腿的毛发，对皮肤进行消毒，并在右后肢早期股动脉结扎的疤痕周围将皮肤切成一圈（图1M）。
   5. 从腿部顶部去除皮肤和脂肪层（图1N，O），并使用缝合线拉开剩余的皮肤，在内收肌周围形成一个口袋（图1P，Q）。
   6. 去除皮下脂肪，以获得内收肌和深动脉/静脉以及侧支血管的清晰视野（图1Q，R）。
   7. 小心地开始去除侧支血管顶部的浅表肌肉层，用细镊子小心地将其解剖出来（图1R）。
      注意:侧支动脉和侧支静脉清晰可见，可进行成像（图1S）。
   8. 用生理盐水填充准备好的口袋以避免组织干燥，并继续对假手术的左后肢进行相同的程序。在成像之前，在两个口袋中加入超声凝胶，以防止干燥并用作与物镜进行光学耦合的浸没介质（图2C和图2F）。

3. 活体多光子显微镜

1. 制备
   注意:将带有超声凝胶的注射器放在显微镜的培养箱室内，以保持温暖的温度，以便在长期成像期间重新填充口袋。
   1. 从两个准备好的口袋中取出盐水，并用超声凝胶代替以覆盖侧支血管（图2C）。
   2. 通过尾静脉导管注射抗体溶液。抗体注射后15分钟，用固定鼠标将垫转移到加热的多光子成像室中（图2F）。
   3. 图像采集完成后，在深度麻醉下通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
2. 多光子显微镜图像采集
   注意:成像前30分钟打开显微镜以进行激光稳定。为了获得显微镜的最佳光学稳定性，建议保持显微镜室永久加热。
   1. 打开Ti:Sapphire激光盒，电子接口盒，培养室加热单元，荧光灯和计算机的钥匙（图2D，E）。
   2. 启动采集软件（检查器软件）。将波长设置为800nm并打开显微镜快门（图3A ii）。
   3. 在测量 向导对话框中，选择 仪器 模式（单光束）和 测量模式 （3D扫描延时摄影）（图3A i）。
   4. 将麻醉小鼠转移到显微镜的预热培养室中。用超声凝胶（步骤2.2.8）直接与物镜前透镜接触的区域（图2F）定位该区域。
   5. 打开落射荧光显微镜快门，为FITC可视化（4）选择适当的滤光片/二向色设置，以通过在落射荧光照明下跟踪血流来找到感兴趣的区域。将感兴趣区域带入中心视野后，关闭落射荧光显微镜快门。
   6. 在 xy扫描仪对话框中，设置以下参数:图像大小（554x554），像素（512x512），频率（400），线平均值（1）（图3A iii）。调整激光功率（5%）（图3A iv），并设置通道绿色（66），红色（66）和蓝色（63）的光电倍增管（PMT）增益（图3A v）。
   7. 为活体成像和漂移校正设置选择合适的物镜（详见3.2.11）。
      注:此处选择的物镜是尼康LWD 16x（图3A vi）。
   8. 通过按下测量向导对话框窗口右上角的红色按钮启动预览采集模式来定义图像堆栈范围（图3A i）。
   9. 通过聚焦来定义感兴趣的区域和结构以获得良好的图像。然后，在观察屏幕的同时，通过将物镜向上移动直到图像消失来改变焦点，并将其设置为零（first= 0）。通过向下移动物镜来改变相反方向的焦点，直到图像再次从屏幕上消失，并将其设置为轴向的最后一个（end= 40μm）位置（图3A vii）。
   10. 将步长设置为 2 μm。单击 "测量向导"对话框 右上角的红色按钮以停止预览扫描。
       注意:图像数量将自动计算和设置（21 张图像），如图 3A vii 所示。
   11. 如果显微镜配备了实时漂移校正⁹，则启动漂移校正软件（例如VivoFollow）并按照以下步骤操作。
       1. 在"测量向导"对话框中，选择Python轴（Python Ax）（图3A viii）作为第一个轴设备;请勿激活自动保存模式。仅在时间轴（时间时间）上选中自动保存 （AS） 框。按"可用设备"窗口上的 Python 图标（图 3A ix）打开"Python "对话框窗口。
       2. 在"Python 轴设置 "对话框中 ，输入" 从" （0 零）和 "到 "（-40）。输入 步数 （21），如图 3A x 所示。
       3. 转到xyz Stage Z对话框窗口，将两端的扫描范围扩大200 μm:在"开始"中，输入（200 μm），在"结束"中输入（-240 μm），范围将自动设置（-440 μm）。保持步长（2μm），如图3A xi所示。
       4. 打开 VivoFollow 前端 对话框并单击 运动配置文件框 （图 3A xii）。
       5. 按下检查器软件" 测量向导"对话框 左上角的绿色箭头开始图像采集（图3A i）。
       6. 如果使用实时漂移校正，请查找一个对话框，显示漂移校正配置，如图3A xiii所示。设置将用作固定标志参考的采集通道（对于此协议，请选择要记录血管示踪剂信号的通道2）。输入添加到第一个和最后一个 z 位置（此处为 200 μm）的最大校正偏移（以 μm 为单位），然后单击 OK。
       7. 在图像采集过程中，在 VivoFollow前面的对话框 窗口中实时监控x、y和z的电流漂移偏移图 3A xiv。
       8. 当需要另一个麻醉重新注射周期时，~35分钟后停止成像采集。注入半剂量的MMF混合物（50μls.c），并通过再次按下绿色箭头重新开始成像采集（步骤3.2.11.5）。
       9. 重复此过程，直到实验完成。

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结果

多光子显微镜为白细胞跟踪提供了高时空分辨率，其中可以跟踪和监测细胞迁移步骤和速度（图4A，B）。然而，样品的生理运动带来了挑战，特别是对于长期活体显微镜图像采集。因此，良好的组织制剂和固定组织和工具的支架，例如组织漂移的实时成像校正，对于成功和稳定的成像采集是必需的。在这里，使用实时漂移工具VivoFollow来校正长期成像采集过程中?...

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讨论

所描述的白细胞募集的多光子 体内 分析方法代表了白细胞募集研究常用工具的补充，例如（免疫）组织学或FACS分析。使用这种成像方法，可以更详细地可视化动脉生成过程中白细胞粘附和外渗的动态过程¹⁰。尽管这种方法具有附加值，但所提供的协议包括一些关键步骤和限制。有关更多故障排除提示，请参阅 表 1 。在切除侧支动脉上的浅表肌层期间，这些?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (7-0)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9