肺移植实验器官捐献模型研究

摘要

本研究显示了三种不同肺捐献模型（脑死亡后捐献、循环后死亡捐献和失血性休克后捐献）的建立。它比较了与这些事件相关的炎症过程和病理疾病。

摘要

实验模型是了解各种病理生理事件所涉及的病因现象的重要工具。在这种情况下，使用不同的动物模型来研究触发移植后原发性移植物功能障碍病理生理学的因素，以评估潜在的治疗方法。目前，我们可以将实验性捐赠模型分为两大类:脑死亡后的捐赠和循环停止后的捐赠。此外，在考虑器官捐献的动物模型时，应考虑与失血性休克相关的有害影响。在这里，我们描述了三种不同肺捐献模型（脑死亡后捐献、循环后死亡捐献和失血性休克捐献）的建立，并比较了与这些事件相关的炎症过程和病理疾病。目的是为科学界提供可靠的肺捐献动物模型，以研究相关的病理机制并寻找新的治疗靶点，以优化移植的可行移植物数量。

引言

临床相关性
器官移植是治疗多种严重疾病的成熟治疗选择。近年来，器官移植的临床和实验领域取得了许多进展，例如对原发性移植物功能障碍 （PGD） 的病理生理学有了更多的了解，并在重症监护、免疫学和药理学领域取得了进展 ^1,2,3。尽管相关外科和药物治疗程序的质量取得了成就和改进，但可用器官数量与等待名单上的接受者数量之间的关系仍然是主要挑战之一^2,4。在这方面，科学文献提出了用于研究可用于器官捐献者的疗法的动物模型，以治疗和/或保存器官直到移植^时 5,6,7,8。

通过模拟临床实践中观察到的不同事件，动物模型可以研究相关的病理机制及其各自的治疗方法。在大多数孤立的情况下，这些事件的实验诱导产生了器官和组织捐献的实验模型，这些模型在器官移植的科学文献中被广泛研究 6,7,8,9。这些研究采用了不同的方法学策略，例如诱导脑死亡 （BD）、失血性休克 （HS） 和循环死亡 （CD） 的方法学策略，因为这些事件与损害捐赠器官和组织功能的不同有害过程有关。

脑死亡 （BD）
BD与一系列事件有关，这些事件导致不同系统的逐渐恶化。它通常发生在由于脑外伤或出血导致颅内压 （ICP） 急性或逐渐升高时。颅内压的这种增加促进了血压的升高，试图在称为库欣反射^10,11 的过程中维持稳定的脑血流。这些急性变化可导致心血管、内分泌和神经功能障碍，从而损害捐献器官的数量和质量，此外还会影响移植后的发病率和死亡率 10,11,12,13。

失血性休克 （HS）
反过来，HS 通常与器官捐献者有关，因为他们中的大多数是血容量严重损失的创伤受害者。一些器官，如肺和心脏，由于血容量不足和随之而来的组织灌注不足，特别容易受到 HS 的影响¹⁴。HS 通过增加毛细血管通透性、水肿和炎症细胞浸润诱发肺损伤，这些机制共同损害气体交换并导致器官进行性恶化，从而破坏捐赠过程 ^6,14。

循环死亡 （CD）
在世界主要中心，CD后捐献的使用呈指数级增长，从而促进了收集器官数量的增加。从CD捐献者身上恢复的器官容易受到温缺血的影响，温缺血发生在低血（激动期）或无血液供应（收缩期）的间隔后^8,15。灌注不足或血流不足将导致与ATP突然丢失和组织中代谢毒素积累相关的组织缺氧¹⁵。尽管目前在临床实践中将其用于移植，但对于使用这些器官对移植后移植物质量和患者生存的影响仍然存在许多疑问¹⁵。因此，使用实验模型来更好地了解与CD相关的病因也在增长8,15,16,17。

实验模型
有各种实验性器官捐献模型（BD、HS 和 CD）。然而，研究通常一次只关注一种策略。在结合或比较两种或多种策略的研究中存在明显差距。这些模型在开发旨在增加捐赠数量从而减少潜在接受者的等待名单的疗法方面非常有用。用于此目的的动物种类因研究而异，当目标是更直接地翻译人类形态生理学并且由于动物的大小而在外科手术中减少技术难度时，更常选择猪模型。尽管有好处，但物流困难和高成本与猪模型有关。另一方面，生物操作的低成本和可能性有利于使用啮齿动物模型，使研究人员能够从可靠的模型开始复制和治疗病变，并整合在器官移植领域获得的知识。

在这里，我们提出了一个脑死亡、循环死亡和失血性休克捐献的啮齿动物模型。我们描述了与这些模型相关的炎症过程和病理状况。

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研究方案

动物实验符合圣保罗大学医学院实验动物使用和护理伦理委员会（协议编号 112/16）。

1. 动物分组

1. 将12只雄性 Sprague Dawley 大鼠（250-300g）随机分配到三个实验组（n = 4）之一，以分析和比较与动物模型相关的效果。
2. 将动物分配到失血性休克组（HS，n = 4）:动物接受血管导管插入术，诱导失血性休克+维持360分钟+心肺阻滞提取+样品制备分析。
3. 将动物归入脑死亡组（BD，n=4）:动物脑死亡+维持360分钟+心肺阻滞提取+样品制备分析。
4. 将动物分配到循环死亡组（CD，n = 4）:接受血管导管插入术+诱导循环死亡+暂停通气+室温缺血180分钟+样品制备分析的动物。

2.麻醉和术前准备

1. 将大鼠置于含有5%异氟烷的密闭室中1-4分钟。通过检查脚趾捏反射来确认正确的麻醉。在没有反射反应（无爪缩回）的情况下，在小儿喉镜的帮助下进行经口气管插管（14-G血管管）。
2. 使用先前调整的机械呼吸机（FiO₂ 100%，潮气量 10 mL/kg，90 个周期/分钟，PEEP 3.0 cmH₂O），将气管导管连接到呼吸机，并将麻醉剂浓度调节至 2%。
   注意:与动物模型相关的所有程序都遵循本节中描述的相同麻醉方案。
3. 从感兴趣的区域（头部、颈部、胸部和腹部）去除毛皮。然后，使用纱布对手术区域和动物的尾巴进行消毒。用三轮交替的二葡萄糖酸氯己定酒精溶液擦洗进行消毒。
4. 切开动物尾巴的尖端，将拇指和食指放在尾巴的底部，然后按压并将它们从底部滑开。通过尾部收集外周血样本 （20 μL） 以获得总白细胞计数⁸。
   注意:此程序必须在气管切开术开始之前执行，并在每个方案结束时立即执行（BD和HS - 360分钟后）。
5. 使用精密移液管将收集的血液稀释在380μL（1:20）Turk溶液（冰川乙酸99%）中。稀释后，将血液样本移液到Neubauer室中，并将其置于显微镜（40x）下。在腔室的四个外侧象限中进行总白细胞计数。

3. 气管切开术

1. 在适当的剪刀和镊子的帮助下，从颈部的中间三分之一到胸骨上切迹（1.5厘米切口）对颈部气管进行纵向解剖。切开皮肤和皮下组织后，解剖颈部肌肉，直到气管暴露。
2. 在气管下方放置一个 2-0 的丝结扎线。
3. 使用显微剪刀，气管切开气管的上三分之一，以实现均匀通气。在两个软骨环之间水平切割气管，以适应金属套管的直径（3.5 厘米）。
4. 插入通气管并用准备好的结扎线固定。
5. 将通风管连接到小动物通风系统。
6. 用10mL / kg的潮气量，70个循环/ min的速率和3cmH₂O的PEEP给大鼠通风。

4.股动脉和静脉导管插入术

1. 通过腹股沟区域的小切口（1.5 cm）暴露股骨三角。识别并隔离股血管。对于此过程，请使用体视显微镜（3.2 倍放大倍率）。
2. 在血管（静脉或动脉）下方放置两个 4-0 丝结扎线，一个在远端，另一个在近端。闭合最远端的结扎，然后在近端结扎处打一个预先调整的结并拉动。
3. 通过血管中预先形成的小切口插入导管。固定套管以避免脱位。
   注意:使导管从加热焊接的 20 厘米新生儿延长器到适合动物静脉网络口径的外周静脉导管，从而防止血液内容物反流。用肝素润滑套管，避免在平均动脉压 （MAP） 测量期间形成血栓和并发症。
4. 将动脉导管连接到压力传感器和生命体征监测系统，以记录平均动脉压 （MAP）。换能器应放置在动物心脏的水平。每 10 分钟记录一次 MAP。
5. 将注射器导管 （3 mL） 放入静脉中，必要时进行补液和放血。

5.失血性休克诱导

1. 通过静脉通路和肝素化注射器，抽取少量血液，直到 MAP 值 达到 50 mmHg，从而建立失血性休克。
   注意:在实验的第一个小时内每 10 分钟收集一次 2 mL 等分试样，随后每 30 分钟收集一次。
2. 将压力稳定在约50mmHg360分钟。为此，如果压力分别增加或减少，请分别取出或添加等分试样的血液。
3. 在附近放置热源以避免体温过低。
   注意: 这里使用加热灯。
4. 在方案结束时，以总肺活量 （TLC） 收获肺阻滞，并在液氮中快速冷冻或将其置于固定溶液中以进行进一步研究。
   注意:在小动物呼吸机的帮助下，可以在方案期间访问通气参数。在本研究中，这些参数在 HS 诱导前（基线）和 360 分钟后（最终）进行了评估。

6.循环死亡诱导

1. 为了诱导循环死亡，通过静脉管路给予 150 mg/kg 硫喷妥钠。然后关闭通风系统。
2. 注意 MAP 逐渐降低，直到达到 0 mmHg。从这一点开始，考虑温暖缺血期的开始并开始时间计数。动物应在室温（约22°C）下保持180分钟。
3. 在方案结束时，将肺部重新连接到机械呼吸机，并在 TLC 收集肺阻滞以进行收集。使用液氮快速冷冻或将其放入固定溶液中以进行进一步研究。

7.脑死亡诱导

1. 将老鼠置于俯卧位。
2. 使用手术剪刀从颅骨上取下皮肤。钻一个 1 毫米口径的钻孔，前方 2.80 毫米，前方 10.0 毫米，矢状缝线外侧 1.5 毫米。
3. 将整个球囊导管插入颅腔，并确保球囊预先充满生理盐水（500μL）。
4. 在注射器的帮助下，迅速给导管充气。
5. 通过观察 MAP 突然升高（库欣反射）、反射消失、双侧瞳孔散大和呼吸暂停来确认脑死亡。确认后，停止麻醉并使动物保持机械通气360分钟。
6. 在附近放置一个热源以避免体温过低。
7. 在方案结束时，在TLC收集肺阻滞进行收集，并在液氮中快速冷冻或将其置于固定溶液中以进行进一步研究。
   注意:在小动物呼吸机的帮助下，可以在方案期间访问通气参数。在本研究中，我们在 BD 诱导前（基线）和 360 分钟后（最终）评估了这些参数。

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结果

平均动脉压 （MAP）
为了确定 BD 和 HS 的血流动力学影响，在方案的 360 分钟内评估了 MAP。基线测量值分别在皮肤去除和颅骨钻孔后以及分别对接受 BD 或 HS 的动物的血液等分试样采集之前收集。在BD和HS诱导之前，两组的基线MAP相似（BD:110.5±6.1vs.HS:105.8±2.3mmHg;p=0.5;双因素方差分析）。导管吹气后，BD组的血压水平突然升高（138.7±10.1mmHg）。高血压峰值是与颅内压升高相关的特殊事件?...

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讨论

近年来，脑死亡诊断数量的增加导致它成为用于移植的器官和组织的最大提供者。然而，这种增长伴随着循环死亡后捐赠的惊人增长。尽管具有多因素性质，但大多数死亡原因的触发机制始于或伴随大量血源流失的创伤^之后4,18。

在这种情况下，脑死亡、循环停止和失血性休克的实验模型是前瞻性研究与供体死亡原因相关的并发症?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers