海绵状神经损伤大鼠模型中的海绵体内压力记录

摘要

该方案描述了开发与勃起功能障碍和海绵体内压力测量相关的根治性前列腺切除术的稳定双侧海绵状神经损伤大鼠模型。

摘要

双侧海绵状神经 （CN） 损伤大鼠模型已广泛用于模拟与勃起功能障碍 （ED） 相关的临床海绵状神经损伤，以评价临床治疗方法的效果。然而，在 ED 研究领域，CN 损伤模型的构建方法存在缺陷和差异。CN 挤压伤是近年来最常用的方法。本研究旨在详细描述双侧 CN 损伤大鼠模型的构建和海绵体内压 （ICP） 记录的测量过程，提供可靠且可重复的 CN 损伤大鼠模型。本研究成功开发了以注射器针头为硬支撑，以橡胶套为止血钳的止血器挤压伤CN损伤方法。此外，该方法得出结论，1.0 V 的电压、20 Hz 的频率和 5 ms 的脉冲宽度是双侧 CN 损伤大鼠模型中 ICP 记录的优化刺激参数。

引言

ED 是成年男性的常见疾病之一。据估计，到 2025 年，全球 ED 患者人数将达到 3.22 亿¹。中国一项多中心广泛抽样调查显示，盆腔手术或创伤引起的 ED 比例约为 8%²。尽管手术技术和手术器械不断改进，但 ED 的发病率仍然很高。已经认为，保留神经的根治性前列腺切除术 （RP） 后 ED 的发生和进展会导致海绵状神经损伤，导致海绵体平滑肌萎缩、内皮细胞凋亡和病理重塑 ^3,4。

为了研究与 ED 相关的 CN 损伤的血流动力学和组织病理学变化的机制，已经开发和评估了几种不同类型的 CN 损伤动物模型，包括啮齿动物、狗、猫和猴 ^5,6,7。依靠在支出和可重复性方面的优势，双侧 CN 损伤大鼠模型已成为评估根治性盆腔手术后 ED 的最常见模型⁸。然而，许多文献中已经报道了各种形式的神经损伤，其主要区别在于神经损伤方法（挤压、冷冻、横断和切除）^9,10,11。此外，神经损伤方法的多样性可能导致大鼠模型中海绵体内压 （ICP） 记录参数的不一致，这决定了 ICP⁸ 的准确性和评估。然而，目前还没有一种标准化的方法来诱导神经损伤和记录模型的 ICP。

因此，本研究旨在构建更可靠、重现性的双侧 CN 损伤大鼠模型。该方法详细描述了模型构建和 ICP 测量的过程，这可能有利于研究 ED 的机制和未来开发有效的治疗方法。

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研究方案

本研究使用了 15 只体重在 300-350 g 之间的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠 （3 个月大）。所有动物程序均按照 NIH 实验动物护理和使用指南进行，并经中山大学附属第五医院机构动物护理和使用委员会批准。动物被安置在一个舒适的设施中，温度和光线都受到控制。

1. 手术资料的准备

1. 准备以下器械：手术刀、组织剪刀、线剪刀、弯曲镊子、组织镊子、显微外科镊子、哈特曼蚊子止血钳、无菌手术片、微针架、大鼠腹部牵开器以及生物信号采集和处理系统（见 材料表）。
   1. 手术前对所有手术器械进行消毒。使用酒精（70% 乙醇）湿巾清洁手术区域。
      注意：手术器械应通过酒精浸泡过夜进行消毒。
2. 准备压力记录系统
   1. 将含有肝素盐水的 10 mL 注射器和皮下注射 25 G 针头连接到带管子（20 cm 长）的 3 通旋塞阀。用无菌肝素盐水 （200 U/mL） 冲洗消毒管。
      注意：用肝素盐水填充试管可避免将气泡引入系统。
3. 将 25 G 针头抬高至动物作垫上方 20 cm（正好管长）。然后通过冲洗或敲击来检查压力记录系统的测量精度。

2. 动物的准备

1. 通过戊巴比妥钠（60 mg / kg）腹膜内注射麻醉大鼠（见 材料表）。
   注意：为了确认足够的麻醉深度， 通过捏后 爪对大鼠的自主呼吸节律和反射进行了评估。
2. 在双侧眼睛上涂抹软膏以避免角膜干燥。
3. 确认麻醉正确后，使用电动剃须刀剃除腹部、颈部和会阴的下半部分。将大鼠仰卧在加热垫 （37 °C） 上。在外科手术过程中佩戴医用手套以保持无菌条件。

3. CN 隔离和损伤程序

1. 使用手术刀在腹部下部中线的皮肤上切开 4 厘米。要完全暴露膀胱和前列腺，请使用组织剪刀和组织镊子在皮下筋膜、肌肉组织和腹膜上做一个适当长度的切口。
2. 使用大鼠腹部牵开器放大手术野图。使用吸水棉签将前列腺与邻近组织（如韧带）分开。
   注意：主要盆腔神经节 （MPG） 和 CN 可以在前列腺的两个背外侧区域之一找到。
3. 使用有角度的微型剪刀切开覆盖在 MPG 远端 1-6 mm 的 CN 筋膜。然后使用显微手术钳将 9-0 缝合线滑入 CN 下方。
4. 将注射器针头 （25 G） 放在 CN 下方，距离 MPG 5 毫米。然后将止血钳置于“止血钳尖端 - 注射器针头 - 神经 - 止血钳尖端”三明治结构下（图 1 和 图 2）。
   注意： 注射器针头需要研磨平整。
5. 在距离神经节 5 mm 处使用全尖端封闭的止血钳 1 分钟，然后撤回止血钳和注射器针头（图 2）。
6. 通过 9-0 缝合线稍微抬起神经，并将双极电极的钩子（见材料表）放在 MPG 远端 2-4 mm 的 CN 周围（图 3）。
   注意：两对 MPG 和 CN 以相同的方式作。

4.体导管插入术和刺激 CN 以进行 ICP 测量

1. 在将管子引入海绵体之前，用无菌肝素盐水 （200 U/mL） 冲洗管子。
2. 握住 25 G 针，保持插入方向与海绵体的路线平行（图 3）。
   注意：应拉伸白膜以方便插入。
3. 将 25 G 针头推入海绵体 6 毫米（图 3）。冲洗管子并轻轻按压海绵体以评估换能器的灵敏度（图 4）。为防止意外脱落，请用胶带将管道固定在工作台上。
4. 使用以下参数进行 CN 刺激：1.0 V 的电压，20 Hz 的频率，5 ms 的脉冲宽度。在下一次刺激之间施加 1 分钟的刺激和 5 分钟的休息。
   注意： 开始测量时，将 3 通旋塞阀转到压力传感器通道。

5. 术后护理

1. 将大鼠放在加热的垫子 （37 °C） 上并仔细监测它们的麻醉恢复情况。
2. 为了控制术后疼痛，当大鼠完全恢复时，提供非甾体抗炎药（如卡洛芬，0.5 mg/kg，皮下注射）（见 材料表）。
3. 将大鼠移至无菌笼中并监测它们 2 天，以评估切口伤口的营养状态、精神状态和感染。

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结果

手术程序使用该方案和推荐的刺激设置产生了典型的 ICP 反应曲线。当刺激神经时，ICP 反应曲线立即上升，当刺激撤回时下降（图5）。在测量 ICP 之前必须检查海绵体内压力线，这会影响 ICP 值增加的评估（图 4）。

如图 6 所示，当正常大鼠的电压高于 1.0 V 时（无海绵状神经损伤）?...

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讨论

ED 是盆腔手术或创伤的严重并发症。尽管接受了保留神经的手术，但在根治性前列腺切除术 （RP） 中，ED 的发生率约为 ^14-90%12。由于损伤 CN 再生有问题，临床疗效不尽如人意。因此，用于探索 ED 治疗的稳定 CN 损伤动物模型是必不可少的。Quinlan 等人首次报道了用于 RP 相关 ED¹³ 研究的 CN 损伤大鼠模型。几项研究基于 Quinlan 模型开发了 ...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G needle	BD Bioscience	367391
Abdominal retractor	RWD Life Science	R22009-01
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Bending forceps	RWD Life Science	F12011-10
Biological signal acquisition and processing system	Techman Software	BL-420S
Bipolar electrode	Techman Software	AC0047
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
HARTMAN mosquito hemostatic forceps	RWD Life Science	F22002-10
Heparin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	2608411
Micro needle holder	RWD Life Science	F31047-12
Microsurgery forceps	RWD Life Science	F11001-11
Scalpel	RWD Life Science	S32003-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
Thread scissors	RWD Life Science	S15001-11
Tissue forceps	RWD Life Science	F13019-12
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14