体内 熟练运动行为的无线光遗传学控制

摘要

本实验方案描述了如何在单个颗粒到达抓取任务中使用无线光遗传学与高速摄像相结合，以表征参与自由移动小鼠中熟练运动行为表现的神经回路。

摘要

精细运动技能在日常生活中是必不可少的，在几种神经系统疾病中可能会受到损害。这些任务的获取和执行需要感觉 - 运动整合，并涉及对双侧脑回路的精确控制。在动物模型中实施单手动行为范式将提高对大脑结构（如纹状体）对复杂运动行为的贡献的理解，因为它允许在任务执行期间在控制条件和疾病中操纵和记录特定细胞核的神经活动。

自创建以来，光遗传学一直是通过对神经元群体进行选择性和靶向激活或抑制来询问大脑的主要工具。光遗传学与行为测定的结合揭示了特定大脑功能的潜在机制。带有小型发光二极管（LED）的无线头戴式系统允许在完全自由移动的动物中进行远程光遗传学控制。这避免了有线系统对动物行为限制较少的限制，而不会影响发光效率。目前的协议将无线光遗传学方法与高速摄像相结合，用于单手动灵巧性任务，以剖析特定神经元群体对精细运动行为的贡献。

引言

在我们执行的大多数运动中都存在运动技能行为，并且已知在几种脑部疾病中受到影响^{1，2，3，4，5，6}。实施允许研究熟练运动的发展，学习和表现的任务对于理解运动功能的神经生物学基础至关重要，特别是在脑损伤，神经退行性和神经发育障碍的模型中^2，7，^{8，9，10，11，12，13}.在日常生活行动中，伸手和取回物体是常规的，这是在早期发育过程中获得的首批运动技能之一，然后在^5，6年中得到完善。它包括一种复杂的行为，需要感觉运动过程，例如对物体特征的感知，运动计划，动作选择，运动执行，身体协调和速度调制^{7，14，15，16}。因此，单手动高灵活性任务需要两个半球的许多大脑结构^{的参与16，17，18，19，20，21，22}。在小鼠中，单个颗粒伸手抓取任务的特征是可以单独控制和分析的几个阶段^7，13，23。该特征允许研究特定神经元亚群在不同阶段的习得和行为表现的贡献，并为运动系统^{的详细研究13，23，24}提供平台。运动发生在几秒钟内;因此，高速摄像应用于熟练运动轨迹^7，25的不同阶段的运动学分析。可以从视频中提取几个参数，包括身体姿势，轨迹，速度和错误类型²⁵。运动学分析可用于检测无线光遗传学操作过程中的细微变化^7，23。

使用小型化发光二极管（LED）通过无线头戴式系统传递光，可以在动物执行任务时进行远程光遗传学控制。无线光遗传学控制器接受来自刺激器的单脉冲或连续触发命令，并将红外（IR）信号发送到连接到微型LED^23，26的接收器。目前的方案将这种无线光遗传学方法与灵巧性任务的高速摄像相结合，以剖析特定神经元群体在精细运动行为执行期间的作用²³。由于这是一项单项任务，因此可以评估两个半球结构的参与情况。传统上，大脑以高度不对称的方式控制身体运动;然而，高灵巧性任务需要许多大脑结构的仔细协调和控制，包括同侧核和细胞核^{10，20，21，22，23}内神经元亚群的差异贡献。该协议表明，来自两个半球的皮质下结构控制前肢²³的轨迹。这种范式可以适用于研究脑部疾病的其他大脑区域和模型。

研究方案

涉及动物使用的程序按照当地和国家指南进行，并得到相应的机构动物护理和使用委员会（细胞生理学研究所IACUC协议VLH151-19）的批准。Drd1-Cre转基因雄性小鼠²⁷，产后35-40天，C57BL / 6背景在当前方案中使用。小鼠在以下条件下保存:温度22±1°C;湿度 55%;光照计划12/12小时，晚上7点熄灯，并在产后第21天断奶。断奶的幼崽被安置在2-5的同性组中。动物被安置在带有微屏障顶部的静态外壳中。床上用品由无菌白杨刨花组成。除非另有说明，否则 应随意提供啮齿动物颗粒和RO净化水。

1. 外科手术

1. 根据目标结构的背腹坐标（理想情况下长0.5毫米以考虑颅骨的厚度，对于背外侧纹状体3.5毫米）准备所需长度的LED套管（图1）。
   1. 将玻璃纤维切割成比最终所需尺寸更长的长度，用粗糙的砂纸将纤维尖端研磨到目标长度，最后用细砂纸抛光纤维尖端。
      注:LED套管是一种直径为250μm的玻璃光纤，连接到红外接收器上（参见 材料表）。
2. 用水平拉拔器拉动纳米注射器的玻璃移液器（外径1.14 mm，内径0.53 mm，长度3.5英寸）（参见 材料表）并存储它们以备后用。在一个回路中对拉拔器进行编程，以获得15-20μm的尖端直径和长渐变斜率锥度（4-5 mm）。
3. 通过用70%乙醇彻底消毒立体定位器，罩，微注射器（见 材料表）和周围表面来准备手术区域。
   注意:小鼠立体定位设备对于精确注射腺相关病毒（AAV）并将LED套管放置在感兴趣区域至关重要。
4. 为手术穿戴适当的个人防护装备，包括干净的实验室外套或一次性手术服、无菌手套、口罩和一次性头盖。
5. 将必要的设备放置在靠近手术区域的位置，例如无菌手术工具，棉吸头，溶液，微量移液器，移液器吸头，毛细血管，矿物油微填充和标记物。
6. 用矿物油填充移液器进行显微注射，并将其放入微量注射器中。通过喷射一些矿物油来确保微型注射器正常工作。
   注意:手术期间使用的所有器械都应经过高压灭菌和无菌处理。应使用无菌技术。
7. 在整个手术过程中，用气态异氟醚4-5%麻醉动物以诱导麻醉，在整个手术过程中用0.5-1 L / min纯氧麻醉1.2%。手术仅在动物达到深度麻醉点后开始，通过轻微捏合后没有爪子退出来评估。
   1. 持续监测动物的呼吸频率和温度。通过设置为34°C的加热垫保持体温。
8. 涂抹眼药膏。用三角体和脱毛膏从头皮上去除毛发。用含有8%聚维酮碘（见 材料表）和70%乙醇的棉签擦拭头皮，各交替三次。
9. 将鼠标放在立体定位装置中并固定头部，确保颅骨在中外侧和前后轴上水平。
10. 用手术刀沿着矢状轴在眼睛水平处的头皮上做一个1厘米的切口。缩回皮肤以暴露颅骨，并用棉签清洁骨膜。
11. 用盐水溶液和无菌棉签清洁颅骨表面。使用无菌吸收性眼矛（见 材料表）或类似的无菌吸收材料解决表面的任何出血。
12. 用棉签滴下2.5%的过氧化氢，让它作用几秒钟，使颅骨缝合线可见，并有更好的参考。几秒钟后，用干净的棉签彻底清洁。
13. 使用玻璃移液器（最终吸头直径15μm），定位前凸和λ，以检查颅骨是否在前后轴上水平。
    注意:建议使用立体显微镜或USB显微镜来观察玻璃移液器的尖端。如果需要，调整嘴架的高度以调平头骨。
14. 将毛细血管向选定的前后 （AP） 和内侧 （ML） 坐标移动（背外侧纹状体 AP 1.2 mm，ML 2.28 mm）。在头皮上绘制一个参考点，上面有一个无菌标记。
15. 在参考点，使用无菌旋转工具或用小型圆形牙钻头以低到中速对颅骨进行约1 mm的开颅手术，对颅骨施加轻柔的压力（参见 材料表）。
16. 在毛细管中加载300-400 nL Cre依赖性腺相关病毒（AAV），例如AAV1-dflox-hChR-2-mCherry以表达Channelrhodopsin，或AAV仅表达报告蛋白（例如mCherry）作为感兴趣区域的对照（参见 材料表）。检查尖端是否不堵塞，然后在所需的背腹（DV）坐标（背外侧纹状体DV -3.35 mm）处将玻璃移液器引入大脑。
    1. 使用自动进样器以 23 nL/s 的速率注入 200 nL。完成注射后等待10分钟，缓慢取出玻璃移液器以避免溢出。
       注意:可以使用30 G针头注射适当的微型注射器。
17. 用棉签清洁并干燥任何残留物。
18. 将无菌玻璃LED套管连接到立体定位臂上，并使用bregma作为参考校准坐标。非常缓慢地插入套管（300μm / min）以避免组织损伤，并将其放置在注射部位上方100μm处。
19. 一旦LED套管就位，在开颅手术边缘加入一滴（100μL）组织粘合剂。
20. 按照制造商的说明准备牙科水泥混合物（参见 材料表），将纤维固定在颅骨上。
    注意:简而言之，使用冷却的瓷盘，以便在水泥凝固之前有更多的工作时间。将2勺树脂透明粉末加入瓷盘中，加入4滴快速基底和1滴催化剂，然后充分混合。如果需要更薄或更厚的粘度，可以调整粉末/液体比例。
21. 使用无菌刷，将牙科水泥混合物一点一点地涂抹在套管连接器周围，建立层，直到颅骨被覆盖并且连接器牢固地连接到颅骨上，使针脚完全自由。避免在小鼠的皮肤上沾上牙齿水泥。
22. 让其完全干燥。
23. 使用组织粘合剂关闭植入物周围的皮肤（参见 材料表）。
24. 将鼠标放在33°C加热垫上的恢复笼中，监测是否存在以下一种或多种疼痛/不适迹象:1）驼背，缺乏或运动活动减少，2）未能梳理反映在未清洁的脏衣中，3）过度舔舐或抓挠，切口部位发红， 4）攻击性行为，5）厌食或脱水，6）缺乏巢形成。
    注意:在所有程序中将鼠标单独关在笼子里，以避免植入物脱落。在套管脱离的情况下，通过注射150mg / kg戊巴比妥钠进行安乐死，然后在达到深度麻醉后斩首。
25. 皮下注射（SC）美洛昔康1mg / kg，每日一次，术后三天，以提供镇痛。
26. 在进一步操作之前，至少等待 7 天以完全恢复，等待 14 天进行视蛋白表达。
    注意:每12小时进行一次术后随访，持续三天，然后每天检查动物，直到实验结束时安乐死之日。

2."触及即抓"培训

1. 在手术后第7天，开始食物剥夺方案²⁸。连续三天称量小鼠体重以确定其平均体重。然后，安排食物限制，以便动物获得足够的营养，以保持大约90%和不低于85%的体重。
   注意:这是通过每天提供2.5-3克食物来实现的。每天监测动物的体重，并评分整体幸福感，观察动物的行为和外观，例如，皮毛和眼睛外观。使用参考文献²⁹ 中的身体状况评分系统。
2. 在训练前，训练和测试期间，除了标准食品颗粒外，每天为每只小鼠提供20个颗粒（20毫克无尘巧克力味颗粒）（参见 材料表）（在任务期间或之后食用）。
3. 在习惯化前三天，将0.4克/动物/天20毫克无尘巧克力味颗粒散落在家用笼子里，这样老鼠就可以熟悉这些颗粒，这些颗粒在伸手可及的抓取任务中作为奖励。
4. 通过在预训练前一天将它们放在测试室中10分钟来习惯化小鼠，并将散布在室地板上的沉淀（图1A）。
5. 训练和测试后，每天允许进食。每天保持类似的时间表。
6. 在预训练的第一天，将小鼠放在伸手抓取室中，并从前面观察。将颗粒放在靠近开口的腔室前面，以便它们开始消耗颗粒。在这个阶段，允许小鼠以任何形式抓住颗粒。
7. 在训练前的第二天，将颗粒放置在离开口越来越远的地方，直到将它们放到压痕处（距离开口1厘米），以便小鼠可以塑造它们的伸手到抓握的运动（图1C）。
8. 训练小鼠跑到笼子的后部，然后回到笼子开口接受下一个食物颗粒，作为个性化试验的策略。
   注意:这可以通过等到鼠标在笼子的后部，然后再在每次试验的压痕中放置颗粒来实现。
9. 放置颗粒，用右爪或左爪抓住。
   注意:小鼠开始优先使用一只爪子来抓握，这将在接下来的几天的训练和测试中使用。
10. 每天训练动物6天，持续20次试验，或直到最多10分钟过去。从训练的第2天开始，放入模拟接收器（尺寸为12 x 18 x 7 mm，1 g，参见 材料表），这样小鼠在执行任务时就会习惯于体重（图1B）。每天对命中和错过的试验次数进行评分。
11. 使用常规相机记录行为，并从腔室前部捕获30-60帧/秒。此外，可以在训练室下方以45°角放置一面镜子，以监测动物的姿势（图1D，E）。
12. 对于 事后 运动学分析（图2），以45°的角度安装高速相机（参见 材料表），以从保持架侧面进行记录。如果需要3D分析，请放置第二个高速相机，从腔室前部以35°角进行记录;根据动物的侧面，两个摄像头都应放置在笼子的右侧或左侧，并应以相同的帧速率捕获并同步⁷ （图3D，E）。
13. 如果可能，将高速相机设置为 100 帧/秒，分辨率为 376 x 252 像素或更高。将白色聚苯乙烯泡沫塑料壁放在腔室的侧面和背面，以减少背景并增加对比度（图1E）。
14. 在测试当天，用红外接收器替换模拟单元以进行无线光遗传学刺激（图1B，C）。
15. 当小鼠开始伸展时，用遥控器手动转动LED套管，以便在执行行为时进行连续刺激，并且不超过2秒。对自动刺激范式进行编程是优选的。刺激装置触发470nm（蓝光）的LED，尖端的强度为1.0 mW / mm²。
16. 收集视频以进行进一步检查，包括评分和运动学分析。

3. 事后组织学确认

1. 实验完成后，确认病毒表达和LED套管放置。用氯胺酮100毫克/千克和甲苯噻嗪10毫克/千克的混合物麻醉动物。一旦小鼠出现深度麻醉的迹象（步骤1.7），用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注，然后注射4%PFA。
2. 用镊子牢牢抓住接头并轻轻拉起，小心地取下植入的套管。
3. 提取并在4%PFA 23中将大脑固定²⁴小时。
4. 用PBS进行3-10分钟的洗涤。
5. 使用切片机将大脑切成50μm切片（参见 材料表）。
6. 使用带有DAPI的硬定安装介质将切片安装在载玻片中，以染色细胞核和盖玻片。
7. 干燥后，在共聚焦显微镜下观察切片，并验证植入的套管位置和与任何荧光蛋白融合的Ch2R的表达。

结果

伸手可及的任务是一种范式，广泛用于研究不同实验操作下精细技能运动的塑造，学习，表现和运动学。小鼠在几天内学会执行任务，并在训练5天后达到平台，准确率超过55%（图2A，B）。与之前报道的类似，一定比例的动物没有适当地执行任务（29.62%），这些动物应从进一步分析中排除³⁰。这些包括非学习小鼠的子集（6/54只小鼠，11.1%），从?...

讨论

在明确定义的行为范式中使用神经元群体的光遗传学操作正在推进我们对运动控制机制的知识^7，23。无线方法特别适用于需要对多种动物进行测试或自由移动^{的任务34，35}。然而，随着技术和设备的改进，它应该是任何行为任务与光遗传学相结合的首选^34，36。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia machine	RWD	R583S	Isoflurane vaporizer
Anesket	PiSA		Ketamine
Breadboard	Thorlabs	MB3090/M	Solid aluminum optical breadboard
Camera lense	Canon		50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system	BrainVision	MiCAM02	Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution	PiSA		Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber	In house
Drill bit #105	Dremel	2 615 010 5AE	Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets	Bio-Serv	F05301
Ethyl Alcohol	J.T.  Baker	9000-02	Ethanol
Eyespears	Ultracell	40400-8	Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso	VetOne	V1 502017-250	Isoflurane
Glass capillaries	Drumond Scientific	3-000-203-G/X	Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide	Farmacom		Antiseptic
High-speed camera	BrainVision	MiCAM02-CMOS	Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter	Teleopto
Insulin syringe
LED cannula	Teleopto	TelC-c-l-d	LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL	Eppendorf	Z740436
Micro-pipette puller	Sutter	P-87	Horizontal puller
Microscope LSM780	Zeiss		Confocal microscope
Microtome
Mock receiver	Teleopto
NanoJect II	Drumond Scientific	3-000-204	Micro injector
Oxygen tank	Infra	na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA	Addgene	20297	Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde	Sigma	P-6148
Phosphate saline buffer	Sigma	P-4417	Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL	ThermoFisher	AM12635	0.5-10 uL  volume
Pisabental	PiSA		Sodium pentobarbital
Plexiglass	commercial		Acrylic sheet
Povidone iodine	Farmacom		Antiseptic
Procin	PiSA		Xylacine
Puralube	Perrigo pharma	1228112	Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool	Kmoon	Mini grinder	Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus	Stoelting	51730D	Digital apparatus
Super-Bond C&B	Sun Medical		Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller	Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line	Gensat	036916-UCD	Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
TPI Vibratome 1000 plus	Peico		Microtome
Vectashield mounting media with DAPI	Vector laboratories	H-1200	Mounting media
Wireless receiver	Teleopto	TELER-1-P