通过超声引导注射产生胰腺癌细胞的原位异种移植物

摘要

我们提出了一种方案，通过超声引导下注射人胰腺癌细胞并随后通过超声成像监测 体内 肿瘤生长来生成微创原位胰腺癌模型。

摘要

胰腺癌（PCa）是全球最致命的癌症类型之一。PCa恶性肿瘤的原因主要依赖于其内在的恶性行为和对治疗的高耐药性。事实上，尽管做出了许多努力，但标准化疗和创新靶向疗法在从临床前评估转移到临床环境时都失败了。在这种情况下，迫切需要开发更好地模拟PCa 体内 特征的临床前小鼠模型来测试新开发的药物。本协议描述了一种生成PCa小鼠模型的方法，该方法由通过超声引导下注射人胰腺肿瘤细胞获得的原位异种移植物表示。使用这种可靠和微创的方案，我们还提供了 体内 植入和肿瘤肿块发展的证据，可以通过超声（US）成像进行监测。这里描述的PCa模型的一个值得注意的方面是肿瘤肿块随着时间的推移缓慢发展，这允许精确识别药物治疗的起点并更好地监测治疗干预的效果。此外，这里描述的技术是实施3R原则的一个例子，因为它最大限度地减少了疼痛和痛苦，并直接改善了研究中动物的福利。

引言

PCa及其最常见的形式胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的最常见原因之一，无论1，²阶段如何^，1年生存率低于20%，5年生存率为8%。这种疾病几乎总是致命的，预计其发病率在未来几年将继续增长，不像其他癌症类型，其发病率正在下降³。癌症检测晚期、快速进展趋势和缺乏特异性治疗等因素导致 PCa⁴ 预后不良。由于开发了更准确的临床前小鼠模型，癌症研究取得了巨大进展。这些模型为理解癌症背后的分子机制和开发新疗法提供了适当的见解⁵。这些进展不适用于PCa，尽管最近做出了巨大努力，但PCa仍然对当前的化疗疗法具有抗性¹。由于这些原因，开发改善患者前景的新方法是强制性的。

多年来，已经开发了许多PCa小鼠模型，包括异种移植物，这是当今使用最广泛的模型^5。异种移植模型分为皮下异位和原位，具体取决于植入肿瘤细胞的位置。皮下异位异种移植更容易且更便宜，但错过了PCa的某些特征（即，特殊的肿瘤微环境，其特征是纤维化组织的积累，缺氧，酸度和血管生成）^6，7。这就解释了为什么皮下异种移植物往往无法为治疗提供可靠的数据，导致在转化为临床环境时失败⁸。另一方面，原位异种移植物与肿瘤微环境更相似，从而更好地模仿疾病的自然发展。此外，原位异种移植物更适合研究PCa的转移过程和侵袭性特征，这在皮下模型⁹中几乎不会发生。总体而言，原位异种移植小鼠模型目前优选进行临床前药物测试^9，10。原位异种移植物通常依靠外科手术将细胞或非常小的肿瘤组织碎片植入胰腺。事实上，在过去的几十年里，已经发表了几篇基于PCa手术模型的论文¹¹。然而，用于建立原位肿瘤模型的外科手术的质量和结果在很大程度上取决于操作者的技术技能。用于转化临床方法的成功原位PCa异种移植的另一个关键点是建立具有可预测生长动力学的局部疾病的可能性。

为了解决这些问题，我们在这里描述了一种生产原位PCa异种移植物的创新程序，利用超声（US）引导的人PCa细胞注射到免疫缺陷小鼠的胰腺尾部。此过程将生成可靠的 PCa 鼠标模型。肿瘤生长在 体内 通过US成像进行。

研究方案

本协议已获得意大利卫生部的批准，授权号为843/2020-PR。为了确保无菌条件，动物被保存在佛罗伦萨大学研究动物动物园（Ce.S.A.L.）的屏障室内。所有程序均在佛罗伦萨大学（意大利）LIGeMA设施中饲养小鼠的同一空间中进行。

1. 细胞制备

1. 在含有 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 的 100 mm 培养皿中培养来自 PCa 细胞系的 PCa 细胞，该培养皿补充有 2% L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清 （FBS）。
2. 将细胞在37°C的常氧中用5%CO₂孵育。
3. 用胰蛋白酶分离细胞。计数，并在接种前 1 小时将 1 x 10⁶ 个细胞重悬于 20 μL PBS 中。

2. 超声引导下注射（US-GI）的小鼠制备

注意:以下步骤在无菌条件下进行。US引导注射的整个过程，从麻醉开始到将小鼠从动物平台上取出，大约需要10-12分钟加上5分钟才能完全恢复小鼠。

1. 在干预之前，使用带有27G针头的结核菌素注射器以5mg / kg的终剂量皮下注射卡洛芬（NSAID）或终剂量为5mg / kg的曲马多。
   注意:对于本协议，使用20只无胸腺裸狐^1nu 雌性小鼠。小鼠8周龄，体重20-22克。
2. 打开成像仪，在换能器面板的应用菜单中选择 鼠标（小）腹部 。确保出现B模式（亮度模式）成像窗口，并且系统已准备好获取B模式数据。
   注:B模式是系统的默认成像模式。系统通过根据回波信号幅度分配亮度级别，在二维 （2D） 视图中显示回波。B模式是定位解剖结构的最有效模式。
   1. 转到 学习浏览器。
   2. 选择 "新建 研究"并键入研究名称和信息，即研究日期等。
   3. 在系列名称中填写所有必要的信息，即动物品系、ID、出生日期等。
   4. 点击 完成;该程序已准备好进行B模式成像。
3. 使用4%异氟醚在麻醉诱导室中麻醉小鼠，气体流量为O₂的2L / min。
   注意:大约 4 分钟足以进行适当的麻醉（每分钟呼吸约 50-60 次）。
4. 麻醉小鼠后，改变麻醉机的连接，将异氟醚引导至小鼠处理台。
5. 将麻醉小鼠放在其右翼的处理台上（在37°C下加热），其鼻子在鼻锥中，以确保使用2%异氟醚麻醉小鼠，气体流量为0.8L / min的O₂ （图1A）。
6. 在小鼠的眼睛上滴一滴人工泪液，以防止麻醉时干燥。
7. 用粘性纱布将右手、右脚和尾巴牢固地粘在动物平台上的电极垫上。
   注意:鼠标的呼吸频率和心电图（ECG）通过电极垫记录。

3.US-GI法在胰腺中注射PANC1细胞

1. 用70%乙醇消毒小鼠皮肤，并使用粘性纱布保持左胁皮肤伸展。
   注意:保持皮肤伸展对于减少针头插入的阻力和防止针头变形很重要。
2. 使用20mL注射器（没有针头）在小鼠的腹部和左胁上应用超声凝胶。
3. 使用美国换能器的高度控制旋钮，降低换能器以接触鼠标的左翼，并将其横向放置在动物的身体上。
4. 移动换能器以使用B模式成像在换能器显示屏上可视化胰腺（图1B）。
5. 用30 mm 28 G针头制备50 μL汉密尔顿注射器，其中包含悬浮在20μLPBS中的1 x 10⁶ PANC1细胞，并将注射器放在适当的支架上（图1C）。
   注意:使用前，用70%乙醇消毒注射器针头5-10分钟。
6. 使用支架显微操纵器，将注射器降低到小鼠皮肤上，针头斜面朝上并与超声换能器处于同一平面，与换能器形成45°的角度（图1D）。
   注:从此步骤开始，继续监视显示屏上的美国图像。
7. 使用显微操纵器，穿孔皮肤并将注射器针头插入胰腺并观察显示器上的美国图像，以跟踪其轨迹（图1E）。
   注意:注射前，以胰尾为参考，位于脾脏后面，靠近左肾。
8. 将针头插入胰腺后，通过在注射器柱塞上施加恒定压力，将含有细胞的 20 μL 推注物直接注入胰腺（图 1F）。
   注意:通过胰腺中存在小气泡和低回声液体的流动来检查正确的注射程序，从针尖几乎看不到。
9. 注射整个推注后将针头留在原位5-10秒，然后慢慢缩回。
10. 取下美国换能器，从侧面清洁凝胶，然后将鼠标单独放在新的笼子中。观察动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。

4.3D US成像监测小鼠胰腺肿瘤

注意:肿瘤发展的评估是在细胞注射后8天开始进行的，使用与US引导注射相同的仪器（列在 材料表中）。因此，一些程序，例如系统点火（步骤2.2.），麻醉（步骤2.3.-2.6.）和小鼠放置在动物平台上（步骤2.7.），完全符合上述协议中描述的内容。

1. 在开始美国映像之前，请如图 2A 所示设置工作站。
2. 将换能器固定在3D电机系统上（图2A）。
3. 打开成像仪，然后在研究浏览器上选择新建研究。
4. 将小鼠置于麻醉诱导室（4%异氟醚）中。
5. 将麻醉小鼠放在其右翼，放在37°C加热的处理台上，其鼻子在麻醉管中，并将异氟醚降低至2%（图2B）。
   注意:重要的是将鼠标放置在与US引导注射相同的位置，以保持相同的解剖参考。
6. 在老鼠的眼睛上涂抹一滴兽医软膏。
7. 在小鼠的腹部和左胁上涂上一层超声凝胶。
8. 将55 MHz换能器横向放置以接触左胁皮肤，使胰腺大致居中（图2C）。
9. 使用3D马达在横向方向上采集整个胰腺的图像，理想情况下每次采集收集90-100帧（帧数可能因个人选择而异）。
   1. 在成像器触摸板上选择 3D 电机位置 。
   2. 通过移动光标从双肢获取整个胰腺的图像来指示扫描距离。
   3. 选择 扫描帧 并开始 3D 采集。
10. 完成3D成像后，取出换能器，从皮肤上清洁凝胶，然后将小鼠单独放在新的笼子中以进行恢复。观察动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。

结果

按照上述方案，首先将小鼠麻醉在异氟醚室中，并放置在动物平台上（图1A）。用超声成像观察胰腺（图1B）。将 50 μL 汉密尔顿注射器装载 1 x 10⁶ PANC1 细胞，悬浮在 20 μL PBS 中并放置在针架上（图 1C）。注射器和US换能器之间的最佳角度为45°（图1D）。使用显微操纵器，将注射器针头插入胰腺，并在...

讨论

尽管US成像在临床上的应用很普遍，但许多临床前小鼠模型中的肿瘤发展通常使用生物发光成像来描述¹¹。后者是评估肿瘤植入和扩增的间接方法，它也不能提供可靠的肿瘤生长动力学。在本研究中，我们已将US成像应用于进行细胞注射以及监测肿瘤发展。我们描述的协议和我们提供的结果代表了PCa研究的相关突破。

这里描述的用于胰腺肿瘤细胞注射的US引导...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157