鸡重组肢体测定，以了解细胞分化的形态发生，图案化和早期步骤

摘要

重组肢体是一种强大的实验模型，可以研究细胞分化过程和胚胎信号影响下的模式生成。该协议提出了一种详细的方法，用于生成具有鸡肢 - 中胚层细胞的重组肢体，可适应从不同生物体获得的其他细胞类型。

摘要

细胞分化是细胞承诺的微调过程，导致在发育中的组织和器官的建立过程中形成不同的特化细胞类型。这个过程在成年期得到积极维持。细胞分化是器官发育和体内平衡过程中的一个持续过程。了解细胞分化的早期步骤对于了解其他复杂的过程（如形态发生）至关重要。因此，重组鸡肢是一种实验模型，允许在胚胎模式化信号下研究细胞分化和模式生成。该实验模型模仿 体内 环境;它将重新聚集的细胞组装成从早期肢体芽获得的外胚层覆盖物。之后，外胚层被移植并植入雏鸡胚胎受体中以允许其发育。该测定主要用于评估中胚层肢体芽细胞;然而，它可以应用于来自其他生物体的其他干细胞或祖细胞。

引言

脊椎动物肢体是研究细胞分化，细胞增殖，细胞死亡，模式形成和形态发生^1，2的强大模型。在发育过程中，四肢从来自侧板中胚层¹的细胞中以凸起的形式出现。肢体芽由被外胚层覆盖的中胚层细胞的中央核心组成。从这个早期结构中，出现了一个完整的、形状良好的肢体。肢体萌芽后，识别三个轴：（1）近轴远端轴（[PD]肩部到手指），（2）背腹轴（[DV]从手背到手掌），以及（3）前后轴（[AP]拇指到手指）。近端-远端轴取决于顶端外胚层脊 （AER），即位于肢体芽远端的特殊外胚层。AER是生长，存活维持，增殖和接收信号的细胞的未分化状态^2，3所必需的。另一方面，极化活动区（ZPA）控制前后模式⁴，而背侧和外胚层控制背动脉模式^7，8。三维图案化的集成意味着这三个轴之间的复杂串扰⁵.尽管了解肢体发育过程中的分子途径，但关于控制模式和适当生长以形成整个肢体的机制的悬而未决的问题仍未得到解答。

Edgar Zwilli....

研究方案

这项研究由墨西哥国立自治大学（墨西哥国立自治大学）生物医学研究所实验室动物护理和使用机构审查委员会（墨西哥国立自治大学）审查和批准。该协议的一般步骤的示意图如图 1A所示。

1. 胚胎孵化和活力测定

1. 将受精鸡蛋在38°C和60%相对湿度下孵育约三天半，直到它们达到22 HH阶段（根据Hamilton和Hamburger，1951）¹⁶。
   注意：新鲜受精的鸡蛋可以在15°C下储存长达一周。
   1. 要孵化受精卵，请将受精卵垂直放置，尖头面朝下放入加湿的孵化器中。在孵化期间旋转卵子，因为有必要防止发育中的胚胎粘附在壳膜上。
      注意：受精鸡蛋可以从当地农场获得。受精的白里窝燕子鸡蛋通常用于避免晚期胚胎中羽毛的色素沉着。考虑分别孵化足够的卵子以获得三种结构：（1）肢体中胚层细胞，（2）肢体外胚层，以及（3）供体胚胎以移植RL。
2. 孵化三天半后，从孵化器中取出种蛋，用70%乙醇拭子，然后风干。
3. 识别发育中的胚胎，将卵子倒入，以观察血管并定位胚胎。丢弃没有胚胎的卵子。
   注意：此时，分配卵子以获得中胚层细胞，外胚层和RL的宿主。

2. 获取肢体中胚层细胞以填充外胚层....

结果

识别表现良好的重组肢体
嫁接后，将操纵的胚胎返回到培养箱中以允许RL发育。孵育时间与实验的要求相关。然而，在植入12小时后可以很容易地区分RL。为了确定植入是否充分，观察到RL是牢固附着在供体胚胎的中胚层壁上的突起（图2A）。相反，无论细胞活力和/或移植物失败，RL都与中胚层壁分离或呈现粗糙的形态（图2B）。

讨论

一般来说，RL方案可分为五个步骤：（1）胚胎孵育，（2）获得肢体中胚层细胞以填充外胚层，（3）获得外胚层，（4）组装外胚层覆盖物内的中胚层细胞，以及（5）将填充的外胚层移植到宿主胚胎中。RL技术的主要局限性是冗长，详细的协议，它具有许多需要耐心才能正确执行的关键点。要成功完成协议，需要确定关键时刻。在中胚层细胞采购过程中，细胞的完整性和活力至关重要。细胞死亡会?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01