JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在该协议中，与重组SARS-CoV-2尖峰偶联的量子点使基于细胞的测定能够监测质膜上与hACE2的尖峰结合以及随后结合蛋白进入细胞质的内吞作用。

摘要

细胞荧光显微镜新技术的发展促进了药物发现的高通量筛选方法。量子点是荧光纳米粒子，具有优异的光物理特性，具有明亮稳定的光致发光以及窄发射带。量子点呈球形，通过对表面化学的适当修饰，可用于共轭生物分子用于细胞应用。这些光学特性，加上用生物分子使它们功能化的能力，使它们成为研究受体 - 配体相互作用和细胞运输的绝佳工具。在这里，我们提出了一种使用量子点来跟踪SARS-CoV-2刺突蛋白的结合和内吞作用的方法。该协议可以用作实验者的指南，这些实验者希望利用量子点在细胞生理学的背景下研究蛋白质 - 蛋白质相互作用和运输。

引言

荧光显微镜使研究人员能够使用专门的染料1，遗传编码的荧光蛋白2和量子点（QDs）形式的荧光纳米颗粒3来观察细胞的内部运作。对于2019年严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）全球大流行，研究人员利用荧光显微镜来了解病毒如何在质膜和细胞质中与细胞相互作用。例如，研究人员已经能够深入了解病毒体表面的SARS-CoV-2 Spike蛋白与人类细胞表面的人血管紧张素转换酶2（hACE2）的结合，随后 通过 质膜融合的内化以及Spike:hACE2蛋白复合物的内吞作用4，5。使用细胞荧光成像对SARS-CoV-2 通过 溶酶体从细胞中流出也有很好的见解，这是冠状病毒的一个独特特征，以前被认为是 通过 高尔基体的传统囊泡萌芽发生的，就像许多其他病毒一样6。作为生物学研究几乎所有方面的支柱，细胞荧光显微镜技术在其应用的广度和范围上必然得到发展，从整个动物的超分辨率成像到用于药物筛选的自动高内涵多参数成像。在这里，自动高内涵共聚焦显微镜应用于使用与病毒刺突蛋白偶联的荧光量子点研究SARS-CoV-2细胞进入。

对生物成像平台生成的图像进行高内涵分析，可以比使用多模态读板器获得的全孔强度等单个参数更好地提取有价值的生物学见解7。通过使用自动分割算法分离视野中的物体，可以分析每个物体或一组物体，以查找每个可用荧光通道中的强度、面积和纹理等参数8。将许多测量值组合到多变量数据集中是表型分析的有用方法。当已知所需的表型时，例如Puncta形式的QD内化，可以使用与puncta相关的测量值（例如大小，数量和强度）来评估治疗的疗效。

基于云的高内涵成像分析软件可以容纳各种仪器数据输出，包括高内涵成像平台。通过使用基于云的服务器进行图像存储和在线分析，用户能够从成像仪器或存储数据的网络驱动器上传数据。该协议的分析部分在云软件环境中进行，数据可以以各种文件格式导出，用于下游数据可视化。

SARS-CoV-2病毒由非结构和结构蛋白组成，有助于其组装和复制。SARS-CoV-2尖峰具有两个称为S1和S2的结构域，其中S1包含负责质膜上hACE2相互作用的受体结合结构域9。Spike还被发现与质膜上的其他分子相互作用，这些分子除了hACE210，11之外可能还充当共受体。在整个刺突蛋白序列中，特别是在S1 / S2界面处，存在蛋白酶切割位点，可以在跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）12之后的膜上融合。从单个受体结合域到S1，S2，S1和S2以及来自多个商业供应商的全穗三聚体，已经生产出各种重组SARS-CoV-2 Spike蛋白，用于研究活动13。

在这项工作中，量子点的表面被含有组氨酸标签（QD-Spike）的重组尖刺三聚体功能化。海军研究实验室光学纳米材料科生产的量子点含有硒化镉芯和硫化锌壳14，15。QD表面上的锌协调重组蛋白内的组氨酸残基，形成功能化的QD，其形式和功能类似于SARS-CoV-2病毒颗粒。纳米颗粒和蛋白质偶联的产生之前使用QD偶联受体结合域15进行了描述。该方法描述了细胞培养制剂，QD治疗，图像采集和数据分析方案，可以指导研究人员在人类细胞的生理环境中研究SARS-CoV-2 Spike活性。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

本研究中使用的HEK293T细胞系是一种永生化的细胞系。本研究未使用人类或动物受试者。

1. 细胞培养和接种

  1. 在无菌生物安全柜内，穿着个人防护设备（包括实验室手套、实验室外套和安全眼镜），通过用10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和250μg/mL G418补充Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）来制备细胞培养基。
    1. 对于 500 mL 培养基，加入 443.75 mL DMEM、50 mL FBS、5 mL P/S 和 1.25 mL G418。
    2. 通过0.2μm过滤瓶过滤并保持无菌性，以避免细菌污染。
  2. 在无菌生物安全柜内，将黑色透明底部聚-D-赖氨酸包衣的96孔板内部接种60孔，每孔细胞培养基100μL，其中20，000个细胞。用每孔100μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）填充外部36孔。
    1. 为了计数细胞，将2μL吖啶橙和碘化丙啶染色剂加入18μL细胞悬浮液中。
    2. 将10μL该溶液加载到细胞计数载玻片的一侧。
    3. 重复步骤 1.2.1。和 1.2.2.以加载幻灯片的两侧。
    4. 将载玻片放入自动细胞计数器中。
    5. 选择荧光计数方案，然后按 计数。计算载玻片的两侧并计算两个活细胞密度的平均值。
    6. 要计算所需的细胞悬浮液体积，请将所需的细胞总数除以平均细胞密度。
  3. 在光学显微镜下播种后检查孔，以确保达到适当的密度和分布。
  4. 将板在37°C的加湿培养箱中孵育过夜，其中5%CO 2。

2. 用QD-Spike治疗细胞

  1. 通过在成像培养基中稀释制备0.1%牛血清白蛋白（BSA）。
    1. 对于10mL成像培养基，加入130μL7.5%BSA并混合。
  2. 在12孔储液槽或测定板中，在成像培养基中使用0.1%BSA将440nM QD-Spike（SARS-CoV-2，分离出USA-WA1 / 2020）储备液稀释至20nM。
    1. 对于 1 孔 QD-Spike，将 2.27 μL 440 nM QD-Spike 加入 47.73 μL 0.1% BSA 成像培养基中，最终浓度为 20 nM。
    2. 为了产生六点1:3连续稀释（一式三份），将14.26μLQD-Spike加入285.74μL0.1%BSA成像培养基中，使最高浓度为20 nM。将100 μL 20 nM QD-Spike加入200 μL 0.1%BSA培养基中，使第二次稀释6.67 nM QD-Spike。重复四次以生成六个浓度点。
  3. 使用多通道吸气器，从每个孔中取出所有用过的培养基。使用多通道移液器，用成像培养基（100μL/孔）洗涤一次。
  4. 吸出100μL成像培养基，并返回50μL/孔QD-Spike溶液。
  5. 将板在37°C的加湿培养箱中孵育3小时，其中CO 2为5%。继续执行步骤 4。

3. 固定和细胞核染色

  1. 在无菌生物安全柜内，穿着个人防护装备（包括实验室手套，实验室外套和安全眼镜），在0.1%BSA成像培养基中制备4%多聚甲醛（PFA）。
  2. 从每个孔中吸取50μLQD-Spike，并加入100μL/孔的4%PFA。
    1. 不要让井干涸。使用自动多通道移液器以避免孔干燥（推荐）。
  3. 在室温下孵育15分钟。
  4. 用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次。
  5. 通过将5mM储备溶液稀释至PBS中的1:1000稀释来制备深红色核染料。
  6. 吸出PBS并回50μL/孔稀释的核染料。
  7. 在室温下孵育30分钟。
  8. 用PBS清洗三次。
  9. 使用板封口机对板或密封件进行成像，以便以后进行成像。将板储存在4°C。 荧光应稳定数周或更长时间。

4. 采集设置和成像

  1. 启动映像平台的软件。打开高内容图像处理平台，状态栏上的指示灯应亮起。如果机器未连接，软件将进入离线分析模式。
  2. 登录到映像平台。
  3. 创建新的获取协议。
    1. 选择 板类型 作为96孔透明底部成像板。
      注:仪器中的板选择可能会有所不同，可以通过加载正确的板定义（包括板尺寸，如高度，宽度和其他距离）来定义井间距和焦点来自定义。
    2. 选择 光学模式 为共聚焦，放大倍率为40倍水浸。
    3. 选择" 装箱" 作为 1。
    4. 选择通道和荧光激发/发射波长，如步骤4.3.5-4.3.8中所述。选择设置时拍摄快照以查看图像并确保设置正确。
      注意:数字相衬（DPC）将允许在没有细胞染色或荧光染料的情况下可视化活细胞。不建议用于固定电池。
    5. 选择 DPC 的 模式 （如高对比度）以生成定义明确的细胞体。拍摄快照以确认此设置是否合适，如图像窗口中所示。
    6. 选择 FITC 通道 以用于 ACE2-GFP 细胞系，该细胞系允许可视化细胞内 ACE2 的转运。
    7. 要为 QD 通道创建自定义通道，请选择通道的三角形下拉菜单，然后选择 405 nm 范围内的激发和 608 nm 范围内的发射。
    8. 如果细胞固定并使用深红色核染料，则选择发射大于630nm的远红色通道以进一步描绘细胞体并充当细胞掩模。
    9. 选择具有强细胞质QD信号的孔以设置暴露时间，激光功率和Z高度位置。按照 4.3.10-4.3.13 中的步骤操作。
    10. 检查默认高度是否生成单元格位于所需焦平面中的图像。如果内吞细胞的puncta是靶细胞器，则Z位置将低于质膜是靶细胞器的位置。
    11. 选择一个曝光时间，以产生灰度至少比背景信号高三倍的明亮图像。这通常介于 100 到 300 毫秒之间。在20 nM时，灰度应约为6000 a.u.，曝光时间为200 ms，激光功率为80%。
    12. 通过右键单击每个通道中使用"快照"功能生成的图像并选择" 显示强度"来检查灰度级别。然后，左键单击感兴趣的对象或背景以查看该像素的灰度级别。
    13. 调整激光功率以微调感兴趣物体的强度。
  4. 保存采集协议。
  5. 切换到 运行实验 并输入 板名称。
  6. 运行实验。

5. 数据分析

  1. 将数据导入成像软件。
    1. 采集所有图像后，将测量结果导出到成像软件。这需要建立服务器并创建帐户。为要导出到成像软件中的数据创建一个屏幕。
  2. 在成像软件中，选择 "图像分析 "以开始构建分析协议。
  3. 通过右键单击屏幕列表中的文件并单击 "选择"来加载成像实验中的测量值。成像井及其相关油田的板图应在窗口的左下角可见。
  4. 选择具有明亮细胞质QD斑点的孔以开始图像分割。
  5. 在 "输入图像构建基块"中，选择" 平场校正"。
  6. 通过选择 "查找原子核"将下一个构建块添加到协议中。
    1. 在这里，使用DPC或远红通道作为核标记。
    2. 首先选择准确分割对象的方法，然后使用下拉菜单和调整滑块微调分割。
      注意:良好的分割可以准确地定义细胞核、细胞和斑点的感兴趣区域（ROI）。只有对标记呈正值的像素才应在单个 ROI 中捕获。应排除背景信号。如果在ROI中捕获背景，则可以降低方法的灵敏度，或者可以增加强度阈值以增加分割算法的严格性。这适用于所有"查找"构建基块。
  7. 接下来，添加 查找细胞质构建块 以识别细胞质。
    1. 在这种情况下，使用ACE2-GFP通道进行细胞质分割。
    2. 选择最能识别每个细胞细胞质的方法。
  8. 接下来，添加 "查找点"构建基块 以标识 QD-Spike 点数。
    1. 选择 原子核 作为ROI总体。
    2. 选择 单元格 作为 ROI 区域。这捕获了整个细胞内的puncta。
    3. 选择最能识别每个单元格中 QD 点数的方法。
  9. 一旦图像中的所有物体都已分割并准确识别出该孔，请选择其他孔，以确保构建块和设置通常可以应用于其他孔和其他条件。
  10. 为所有分段对象（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 "计算强度"属性 。
  11. 为所有分段对象（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 "计算形态学属性" 。
  12. 为所有分段对象（细胞核、细胞质/细胞和斑点）添加 "计算纹理属性" 。
  13. 通过选择每个群体的参数（包括细胞核和斑点）来定义结果。物体的数量可以用作细胞活力的间接测量。

6. 导出数据

  1. 单击" 批量分析"。等待分析完成，然后再继续下一步（步骤 6.2）。
    注:批量分析允许图像分析软件服务器使用选定的测量值加载分析协议，以远程分析数据。
  2. 将数据集导出到本地计算机或网络驱动器。
    1. 通过下载并打开连接文件，将图像分析软件连接到计算机上的帮助程序应用程序。
    2. 选择结果文件类型（.txt、.csv、.html或本机 XML）。
    3. 使用下拉菜单选择 "文件夹" 设置。

7. 分析电子表格中的数据

  1. 打开导出的文件。如果它是.csv文件，请将其另存为.xls文件格式，以便能够使用数据透视表。如果文件路径太长，请将.xls文件保存在文件夹层次结构中的较高位置，以避免在保存时出错。
  2. 向电子表格中添加指定每个孔的条件的列。例如，细胞类型，QD-Spike变体，QD-Spike浓度，孵育时间等。
  3. 选择 数据透视表 功能，并使用添加的条件作为 行，将测量参数作为列来构建 表。选择每个参数的计算，即 平均值、标准偏差、中位数、最小值、最大值或 计数。
  4. 对数据进行归一化以控制样品，包括非共轭量子点为0%，QD-Spike的最高浓度为100%。
    注意:如果评估抑制剂（如中和抗体）的疗效，请将数据归一化为仅培养基处理的细胞（100%疗效）和QD-Spike（无抑制剂）（0%功效）。
  5. 在绘图软件中绘制数据。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

在治疗后，量子点将被内化，因为纳米颗粒将与质膜上的ACE2结合并诱导内吞作用。使用表达ACE2-GFP的细胞系，可以使用荧光显微镜观察量子点和ACE2的易位。一旦内化，两个QD和ACE2信号显示出强烈的共定位。从这些图像中，可以执行图像分割和后续分析以提取相关参数，例如点计数（图1， 图2B）。 图1A 是用不同浓度的QD-Spike或培?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

本文中描述的方法为使用高通量共聚焦显微镜对人细胞中的功能化量子点进行成像提供了必要的步骤。该方法最适合于内吞作用是病毒进入的主要途径而不是TMPRSS2和膜融合的活性的细胞，因为它可以研究SARS-CoV-2 Spike和hACE2内吞作用。由于QD模型的性质和市售Spike三聚体上的C端His-tag，Spike S1和S2结构域的任何TMPRSS2切割都将使QD仅附着在S2结构域12上。这可能会阻止内部化，因为 RBD ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

这项研究得到了美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心校内研究计划的部分支持。海军研究实验室 通过其 内部纳米科学研究所提供资金。试剂制备 通过 NRL COVID-19基础基金得到支持。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
32% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2%
Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%
7.5% Bovine Serum AlbuminGibco15260-037Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting
Acridine Orange / Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysineGreiner655946Used to support cell culture, DMEM supplement
Characterized Fetal Bovine SerumCytiva/HyCloneSH30071.03Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1
Columbus AnalyzerPerkin ElmerNAUsed for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye
DRAQ5 (5 mM)ThermoFisher Scientific62252Basal media for HEK293T cell culture
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol redGibco11995-065Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365
ExcelMicrosoftNAUsed to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement
G418InvivoGenant-gn-5Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP
HEK293T hACE2-GFPCodex BiosolutionsCB-97100-203Automated cell counter
Luna Automated Cell CounterLogos BiosystemsNAUsed for fluorescence cell counting
Luna Cell Counting SlidesLogos BiosystemsL12001High-content imaging platform
Opera PhenixPerkin ElmerNAImaging media, used for incubating cells with quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058-021Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying
PBS -/-Gibco10010-023Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement
Penicillin StreptomycinGibco15140-122Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0
PrismGraphPadNAUsed for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)custom made by Naval Research LaboratoryUsed for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse MabSino Biological40592-MM57Used to dissociate cells from flask during passaging
TrypLE ExpressGibco12605-010

参考文献

  1. Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
  3. Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
  4. Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390(2020).
  5. Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
  6. Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
  7. Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
  8. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  9. Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
  10. Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462(2020).
  11. Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80(2020).
  12. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  13. Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
  14. Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
  15. Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
  16. Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
  17. Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
  18. Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。