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摘要

开放式搜索能够鉴定用先前未知的聚糖组合物修饰的糖肽。在本文中，提出了一种简化的方法，用于进行开放搜索和随后以聚糖为重点的糖肽搜索，用于使用 鲍曼不动杆菌 作为模型的细菌样品。

摘要

蛋白质糖基化越来越被认为是细菌生物体内的常见修饰，有助于原核生理学和致病物种的最佳感染性。因此，人们对表征细菌糖基化的兴趣越来越大，并且需要高通量分析工具来识别这些事件。虽然自下而上的蛋白质组学很容易产生丰富的糖肽数据，但在原核生物物种中观察到的聚糖的广度和多样性使得细菌糖基化事件的鉴定极具挑战性。

传统上，在细菌蛋白质组学数据集中手动测定聚糖组成，使得这在很大程度上是一种定制的分析，仅限于特定领域的专家。最近，基于开放式搜索的方法已成为识别未知修饰的强大替代方案。通过分析在肽序列上观察到的独特修饰的频率，开放式搜索技术允许鉴定复杂样品中附着在肽上的常见聚糖。本文介绍了用于解释和分析糖蛋白组学数据的简化工作流程，演示了如何在不事先了解聚糖组合物的情况下使用开放式搜索技术来鉴定细菌糖肽。

使用这种方法，可以快速鉴定样品中的糖肽以了解糖基化差异。使用 鲍曼不动杆菌 作为模型，这些方法能够比较菌株之间的聚糖组成并鉴定新的糖蛋白。综上所述，这项工作证明了开放式数据库搜索技术在鉴定细菌糖基化方面的多功能性，使这些高度多样化的糖蛋白组的表征比以往任何时候都更容易。

引言

蛋白质糖基化是将碳水化合物附着在蛋白质分子上的过程，是自然界中最常见的翻译后修饰（PTMs）之一1，2。在生命的所有领域，一系列复杂的机器已经进化出来，致力于产生糖蛋白，影响无数的细胞功能1，3，4，5。虽然蛋白质糖基化发生在一系列氨基酸6，7上， 但N-连接和 O-链接糖基化事件是自然界中观察到的两种主要形式。 N-连锁糖基化涉及聚糖连接到天冬酰胺（Asn）残基的氮原子上，而在 O-连锁糖基化中，聚糖连接到丝氨酸（Ser），苏氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）残基7的氧原子上。尽管糖基化系统所针对的残基相似，但附着在蛋白质上的聚糖内部的差异导致糖基化是自然界中发现的化学多样性最高的PTM类。

虽然真核糖基化系统具有聚糖多样性，但这些系统通常被限制使用的独特碳水化合物的数量。由此产生的多样性源于这些碳水化合物如何排列成聚糖8，9，10，11，12。相比之下，细菌和古菌物种具有几乎无限的聚糖多样性，因为这些系统内产生的独特糖阵列2，10，13，14，15，16，17。在生命领域观察到的聚糖多样性的这些差异代表了糖基化事件的表征和鉴定的重大分析挑战。对于真核糖基化，预测聚糖组成的能力促进了对糖生物学日益增长的兴趣;然而，细菌糖基化的情况并非如此，它仍然在很大程度上局限于由专业实验室进行研究。随着质谱（MS）仪器在生物科学中的可及性增加，基于MS的方法现在是糖蛋白组学分析的主要方法。

MS已成为表征糖基化的典型工具，现在通常使用自上而下和自下而上的方法来表征糖蛋白6。虽然自上而下的蛋白质组学用于评估特定蛋白质的全局糖基化模式18，19，但自下而上的方法用于实现糖肽的聚糖特异性表征，即使来自复杂的混合物6，20，21，22，23。对于糖肽的分析，信息片段化信息的产生对于糖基化事件的表征至关重要24，25。现在，仪器上通常可以使用一系列碎片化方法，包括基于共振离子阱的碰撞诱导解离（IT-CID），光束型碰撞诱导解离（CID）和电子转移解离（ETD）。每种方法在糖肽分析方面具有不同的优点和缺点25，26，在过去的十年中，在应用这些片段化方法分析糖基化方面取得了重大进展6，20。然而，对于细菌糖基化分析，关键限制不是片段糖肽的能力，而是无法预测样品中潜在的聚糖组成。在这些系统中，多种细菌聚糖的未知性质限制了糖肽的鉴定，即使使用以糖基化为重点的搜索工具现在在真核糖肽的分析中也很常见，例如O-Pair27，GlycopeptideGraphMS28和GlycReSoft29。为了克服这个问题，需要一种替代的搜索方法，使用开放搜索工具成为研究细菌糖基化30的强大方法。

开放搜索，也称为盲或通配符搜索，允许识别具有未知或意外PTMs21，30，31，32的肽。开放搜索利用各种计算技术，包括精选修改搜索、多步数据库搜索或宽质量容忍搜索33、34、35、36、37。尽管开放搜索具有巨大的潜力，但与限制搜索相比，其使用通常受到分析时间的显着增加和未修饰肽检测灵敏度损失的阻碍31，32。未修饰肽光谱匹配（PSM）检测的减少是与这些技术相关的假阳性PSM率增加的结果，这需要增加严格的过滤以保持所需的错误发现率（FDR）33，34，35，36，37.最近，已经出现了几种工具，可以显着提高开放搜索的可访问性，包括Byonic31，38，Open-pFind39，ANN-SoLo40和MSFragger21，41。这些工具通过显著缩短分析时间并实施处理异质聚糖组合物的方法，能够可靠地鉴定糖基化事件。

本文提出了一种通过开放搜索鉴定细菌糖肽的简化方法，以革兰氏阴性院内病原体鲍曼不动杆菌为模型。鲍曼尼具有保守的O-连接糖基化系统，负责修饰多种蛋白质底物，称为PglL蛋白质糖基化系统42，43，44。虽然类似的蛋白质是菌株之间糖基化的目标，但由于用于蛋白质糖基化的聚糖的生物合成来自胶囊位点（称为K-位点）44，45，46，PglL糖基化系统是高度可变的。这导致来自单个或有限聚合K单元的多种聚糖（也称为K单元）被添加到蛋白质底物30，44，46中。在这项工作中，使用开放搜索工具MSfragger，在软件FragPipe中，用于鉴定鲍曼氏菌菌株中的聚糖。通过结合开放搜索和手动管理，可以进行"聚糖重点搜索"，以进一步改善细菌糖肽的鉴定。总之，这种多步骤鉴定方法能够在没有丰富经验的新型糖基化事件表征方面鉴定糖肽。

研究方案

注意:细菌糖肽样品的制备和分析可分为四个部分（图1）。对于这项研究，评估了三种测序 鲍曼氏菌菌株的糖基化（表1）。这些菌株中的每一种的蛋白质组FASTA数据库都可以通过Uniprot访问。有关此协议中使用的缓冲液的组成，请参阅 表 2 。

1. 蛋白质组学分析用蛋白质样品的制备

  1. 分离感兴趣的蛋白质组样品
    1. 如果使用全细胞，请确保细胞已用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤，以除去培养基中存在的潜在蛋白质污染物。洗涤后快速冷冻全细胞，并将其储存在-80°C直至需要。
    2. 如果使用分馏样品（如膜制剂），请确保所使用的试剂不会干扰下游液相色谱MS（LC-MS）分析50。
    3. 如果已使用过十二烷基硫酸钠 （SDS）、Triton X-100、NP-40 或月桂酰肌氨酸等洗涤剂，请使用丙酮沉淀、SP3 样品制备方法51 或商用蛋白质组学净化柱（如 S-traps52）除去这些洗涤剂。或者，用MS相容或可去除的洗涤剂（例如脱氧胆酸钠（SDC）或辛基吡喃葡萄糖苷）代替不相容的洗涤剂。
    4. 确保所有用于样品制备的塑料器皿和玻璃器皿均未经过高压灭菌。高压灭菌的玻璃器皿和塑料通常被小分子量化合物（例如聚合物）严重污染，这些化合物在MS中很容易检测到。
  2. 全细胞样品的增溶
    1. 将〜10mg洗涤的速冻细胞重悬于200μL新鲜制备的脱氧胆酸钠裂解缓冲液（SDC裂解缓冲液:4%SDC在100mM Tris中，pH 8.5）。
      注意:蛋白酶抑制剂可以添加到SDC裂解缓冲液中以限制蛋白质降解。
    2. 将样品在95°C下摇匀（在热混合器上为2000rpm）煮沸10分钟，然后在冰上放置10分钟。重复此过程两次，以确保样品的高效裂解和溶解。
      注意:此时样品可以在-80°C下长期储存。 如果储存，在进一步处理之前，通过在95°C下加热来重新溶解。
  3. 使用比辛可宁酸（BCA）蛋白测定53定量样品蛋白质浓度。将样品储存在冰上，同时进行定量以限制蛋白质降解。
    注意:对于总蛋白质组分析，20-100μg蛋白质对于纳米LC-MS来说绰绰有余，每次分析通常需要不到2μg的蛋白质酶切。过量肽的制备允许重复分析或进一步分馏，如果需要深度蛋白质组学覆盖。对于使用亲水相互作用色谱（HILIC）的基于糖肽富集的分析，需要100-500μg蛋白质。
  4. 减少和烷基化样品。
    1. 向样品中加入1/10th 体积的10倍还原/烷基化缓冲液（100mM Tris 2-羧乙基膦盐酸盐;400mM 2-氯乙酰胺在1 M Tris中，pH 8.5）的体积，最终浓度为1x，并将样品在黑暗中在45°C下孵育30分钟，并以1，500rpm振荡。
      注意:在添加到样品之前，请检查10x还原/烷基化缓冲液的pH值，以确保pH值约为7.0-8.0，因为较低的pH值会导致SDC沉淀。
  5. 短暂地旋转样品并加入蛋白酶胰蛋白酶/ Lys-C（〜10μL，重悬于100mM Tris中，pH 8.5），使最终蛋白酶:蛋白质比为1:100。将消化物在37°C下孵育过夜，以1，500rpm（长达18小时）振荡。为确保蛋白质完全消化，请使用胰蛋白酶/Lys-C 蛋白酶:蛋白质比例为 1:50 至 1:200。
  6. 淬火通过向样品中加入1.25体积的100%异丙醇来消化。涡旋样品1分钟以混合并短暂旋转它们。
    注意:样品可以储存在-20°C下，以便以后进一步处理。
  7. 通过加入0.115体积的10%三氟乙酸（TFA;终浓度〜1%TFA）来酸化样品，涡旋样品，并短暂旋转它们。

2. 蛋白质组样品的处理

  1. 蛋白质组样品的肽纯化
    1. 如前所述54，为每个样品制备一个苯乙烯基苯反相磺酸盐（SDB-RPS）停止和去提取（阶段）尖端。
      1. 根据经验，为了结合50μg肽，使用钝针（14G）从47mm2 SDB-RPS膜上切除三个SDB-RPS光盘。对于较大的肽量，请相应地增加椎间盘的数量。
    2. 在使用SDB-RPS Stage Tips之前，通过依次添加至少十个床体积的以下缓冲液来制备吸头，并通过离心（25°C，3分钟，500× g）或通过使用注射器轻轻施加压力将缓冲液推过色谱柱来使缓冲液通过柱旋转。
      1. 用150μL100%乙腈润湿吸头。
      2. 用150μL30%甲醇，1%TFA在18.2 MΩH 2O中洗涤尖端。
      3. 用150μL90%异丙醇，1%TFA与18.2 MΩH 2O平衡平衡吸头。
    3. 通过离心（25°C，3分钟，500× g）或通过使用注射器轻轻施加压力，将样品（含有50%异丙醇，1%TFA）加载到SDB-RPS载物台吸头上。
    4. 通过离心（25°C，3分钟，500× g）或通过使用注射器轻轻施加压力，用以下缓冲液洗涤SDB-RPS级吸头。
      注意:额外的洗涤剂或替代缓冲液可用于去除非肽污染物，例如使用乙酸乙酯代替异丙醇55。
      1. 用150μL90%异丙醇，1%TFA洗涤尖端。
      2. 用150μL 1%TFA在18.2 MΩ H2O中洗涤尖端。
    5. 通过离心或使用注射器轻轻施加压力，用150μL5%氢氧化铵在80%乙腈中洗脱SDB-RPS阶段尖端中的肽。将样品收集在单独的试管中。
      注意:在通风橱内使用之前，立即在塑料容器中用80%乙腈制备5%氢氧化铵。
    6. 通过在25°C下真空离心干燥洗脱的肽。
      注意:如果进行HILIC富集，此时可以去除1-10%的肽洗脱物，干燥并用作总蛋白质组输入对照。
  2. 糖肽样品的富集
    1. 准备两性离子亲水相互作用液相色谱（ZIC-HILIC）阶段提示，如前所述54，56。
      1. 简而言之，使用钝针（14 G）从47 mm2 C 8膜上切下一个C8圆盘，然后将圆盘包装到P200尖端中以形成熔块。通过使用注射器轻轻施加压力，将约5mm的ZIC-HILIC材料重悬于50%乙腈，50%18.2 MΩ H2O中，加入到熔块上。
    2. 在使用 ZIC-HILIC 载物台吸头之前，通过依次添加以下缓冲液并使用注射器轻轻施加压力来调理树脂。
      注意:为确保ZIC-HILIC树脂表面伪水层的完整性（需要富集糖肽），树脂必须始终保持湿润。洗涤树脂时，始终在树脂上方留下约10μL溶剂，并确保洗涤/样品直接移液到该残留溶剂中。
      1. 用20床体积（200μL）的ZIC-HILIC洗脱缓冲液（0.1%TFA在18.2 MΩ H2O中）平衡树脂。
      2. 用20床体积（200μL）的ZIC-HILIC制备缓冲液（95%乙腈在18.2 MΩ H2O中）洗涤树脂。
      3. 用20床体积（200μL）的ZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液（80%乙腈，1%TFA与18.2 MΩ H2O平衡）洗涤树脂。
    3. 将干燥的消化样品（从步骤2.1.6开始）重悬于ZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液中至终浓度为4μg/ μL（例如，对于200μg肽，重悬于50μLZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液中）。短暂涡旋1分钟以确保样品重悬，并在25°C下在2，000× g 下旋转1分钟。
    4. 将重悬的肽样品上样到条件化的ZIC-HILIC色谱柱上。
      1. 使用注射器轻轻施加压力，用 20 床体积 （200 μL） 的 ZIC-HILIC 上样/洗涤缓冲液（总共 60 床体积洗涤）洗涤三次。
      2. 用20床体积（200μL）的ZIC-HILIC洗脱缓冲液洗脱糖肽通过使用注射器轻轻施加压力进入1.5mL管中，然后通过在25°C下真空离心干燥洗脱液。

3. 蛋白组/富含糖肽的样品的LC-MS

  1. 将样品重悬于缓冲液A*（2%乙腈，0.1%TFA）中至终浓度为1μg/ μL（例如，对于50μg肽，重悬于50μL缓冲液A *）。
  2. 将样品装载到与MS偶联的HPLC / UPLC上，以实现糖肽的分离和鉴定。
    注:色谱柱参数，包括内径、长度、流速、色谱树脂类型和所需的肽注射量，应针对要使用的分析设置和梯度长度进行优化;有关如何优化分析设置的示例，请参见57。
  3. 监控生成的MS数据的收集，确保使用所需的参数收集数据。
    注意:对于成分分析，CID片段化就足够了。由于在糖肽中加入聚糖，通常观察到糖肽离子具有比未糖基化肽更高的 m / z 和更低的电荷密度。为了确保这些离子是可观测的，允许MS1质量范围从400到2，000 m / z。
  4. 使用CID选择片段离子，确保收集含有对聚糖表征重要的氧离子的低 m / z 片段离子。
    注意:使用CID的糖肽的片段化受肽和聚糖序列的影响，以及片段化过程中施加的能量25，58，59。虽然可以使用一系列不同的碰撞能量，但分割糖肽的最佳策略是使用阶梯式碰撞能量，结合使用多种碰撞能量25，59，60。
  5. 如果可用，请使用替代的片段化方法，例如用于位点定位的ETD，或IT-CID以帮助测定聚糖组成。
    注意:这两种片段化方法对于成分分析都不是必需的，但可以收集以进一步询问感兴趣的糖肽。

4. 蛋白质组/富含糖肽的样品分析

  1. 预过滤数据文件以启用在 FragPipe 中进行搜索
    1. 如果在数据集中采集了 ETD 或 IT-CID 扫描，请在使用 FragPipe 进行搜索之前，使用 MSConvert61 从数据文件中筛选这些扫描事件。
      注意:对于下面概述的开放搜索参数，只需要波束型CID数据。
  2. 在 FragPipe 中执行开放搜索
    1. 打开 FragPipe，然后单击 工作流 选项卡。在工作流下拉菜单中，选择" 打开 搜索"选项，然后单击" 添加文件 "以将要搜索的数据文件导入 FragPipe（图 2A）。
    2. 单击数据库选项卡，然后单击下载启动下载管理器。这允许使用 Uniprot 蛋白质组 ID 从 Uniprot 下载蛋白质组数据库。单击下载管理器中的"添加诱饵和污染物"选项，将诱饵和污染物蛋白质合并到数据库中。
    3. 有关更严格的 FDR 阈值，请单击" 验证 "选项卡，然后将 "筛选器和报告" 值从 0.01 修改为 所需的 FDR。
      注意:默认的FragPipe设置将确保蛋白质水平的FDR为1%。
    4. 单击 MSfragger 选项卡。在 峰值匹配 框中，将 前驱体质量公差 从默认的500 Da增加到 2，000 Da ，以允许识别大型修饰（图2A）。
    5. 单击 运行 选项卡并定义 FragPipe 输出的位置。单击" 运行 "按钮开始搜索。
  3. 使用跨数据集识别的PSM（包含在FragPipe的psm.tsv输出中），通过绘制数据集中观察到的δ质量的频率来识别潜在的聚糖（图3）。使用可通过 PRIDE 加入 PXD027820 访问的 R 脚本，从 MSfragger 输出创建增量质量图。
    注意:在这些脚本中对开放搜索结果进行最少的后处理，因为这些脚本的主要目的是帮助可视化增量质量配置文件。重要的是，仅观察丰富的δ质量并不能证明修饰是潜在的聚糖，因为将δ质量指定为聚糖需要进一步分析相应的MS2事件。
  4. 为了能够在样品中表征糖肽，请专注于高置信度δ质量鉴定，对应于具有高超分数的分配。
    1. 为了帮助评估糖肽谱，请使用肽注释工具，例如交互式肽光谱注释器63，它可以在光谱中分配肽相关离子，从而允许手动鉴定聚糖相关离子（图4）。
      注意:在这里提供的数据集中，>30的超评分被认为是高分，因为这些得分对应于所有已鉴定的糖肽的前50%内的得分（图5）。
  5. 通过分配高置信度糖肽，鉴定通常观察到的聚糖相关离子（图4）以改善糖肽的鉴定。
    注意:通过在搜索中加入聚糖相关离子，称为聚糖聚焦搜索，可以提高糖肽分配的质量。
    1. 单击 FragPipe 的 MSfragger 选项卡，将观察到的聚糖的确定的增量质量合并到 变量修饰 和 质量偏移 部分。通过在 "变量修改 "和" 质量偏移" 部分中键入值来添加这些质量，并用 / 分隔单个质量。将这些聚糖的聚糖相关片段团添加到MSFragger的 糖/Labile mods 部分。
      注: 图2B 概述了以聚糖为重点搜索 鲍曼 氏菌菌株AB307-0294所需的关键信息。
  6. 将与蛋白质组学研究相关的所有MS数据上传到集中式蛋白质组学存储库，例如PRIDE或MASSIVE存储库。
    注意:与本研究相关的所有数据都已存入PRIDE蛋白质组学存储库，可以通过PRIDE加入:PXD027820进行访问。

结果

为了说明开放搜索细菌糖肽分析的效用，评估了鲍曼氏菌-AB307-0294，ACICU和D1279779-3株中O-连接聚糖的化学多样性。O-连接的糖蛋白组在鲍曼氏菌菌株之间是高度可变的，因为用于糖基化的聚糖来自高度可变的胶囊位点44，45，46。这种化学多样性使鲍曼氏菌成为开放式搜索研究的理想模型系统。虽...

讨论

开放式搜索是识别未知修饰的有效和系统的方法。虽然在细菌蛋白质组样品中鉴定未知聚糖传统上是一项耗时且技术上专业化的工作，但最近开发的工具如MSfragger21，41 和Byonic31，38 现在能够快速有效地鉴定δ团块，以进一步表征为附着在肽上的潜在聚糖。对标准和富含糖肽的蛋白质组样品进行开放搜索可以鉴...

披露声明

作者没有利益冲突。

致谢

N.E.S.由澳大利亚研究委员会未来奖学金（FT200100270）和ARC发现项目赠款（DP210100362）提供支持。我们感谢Bio21分子科学和生物技术研究所的墨尔本质谱和蛋白质组学设施对MS仪器的使用。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
14 G Kel-F Hub point style 3Hamilton companyhanc90514
2-ChloroacetamideSigma Aldrich Pty LtdC0267-100G
AcetonitrileSigma Aldrich Pty Ltd34851-4L
Ammonium hydroxide (28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent APierce23228
BCA Protein Assay Reagent BPierce23224
C8 Empore SPESigma Aldrich Pty Ltd66882-UAn alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acidSigma Aldrich Pty Ltd5.33002
IsopropanolSigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
MethanolFisher ChemicalM/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)Sigma Aldrich Pty Ltd66886-UAn alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium DeoxycholateSigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
trifluoroacetic acidSigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochlorideSigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixturePromegaV5073
Vacuum concentratorLabconco7810040
ZIC-HILIC materialMerck1504580001Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

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