使用茜素红染色检测斑马鱼幼虫中化学诱导的骨质流失

摘要

在这里，我们使用茜素红染色来证明醋酸铅暴露会导致斑马鱼幼虫的骨量变化。这种染色方法可以适用于研究由其他有害毒物引起的斑马鱼幼虫损失的骨质流失。

摘要

铅（Pb）暴露引起的化学诱导骨质流失可能会对人类和动物骨骼系统产生一系列不利影响。然而，斑马鱼的具体效果和机制尚不清楚。茜素红对钙离子具有很高的亲和力，可以帮助可视化骨骼并说明骨骼矿物质质量。在这项研究中，我们旨在通过使用茜素红染色来检测醋酸铅（PbAc）诱导的斑马鱼幼虫骨质流失。在受精后2至120小时之间用一系列PbAc浓度（0，5，10，20mg / L）处理斑马鱼胚胎。在受精后9天对幼虫进行全支架骨骼染色，并使用ImageJ软件定量总染色面积。结果表明：PbAc暴露组矿化组织呈红色，染色面积显著减少，骨矿化度呈剂量依赖性变化。本文提出了一种染色方案，用于研究PbAc诱导的骨缺损的骨骼变化。该方法还可用于斑马鱼幼虫，以检测由其他化学物质引起的骨质流失。

引言

最近的研究证实，糖皮质激素、芳香酶抑制剂和过量饮酒引起的骨质疏松症很常见^1，2.铅 （Pb） 是一种有毒金属，存在于植物、土壤和水生环境中³.虽然Pb对人体的不良影响备受关注，但其对骨骼的不可逆影响仍需进一步研究。铅中毒会导致发育和成人骨骼发生多种病理变化，影响正常生活活动。研究发现，慢性铅暴露与^{骨损伤之间存在}关联4，包括骨骼结构受损⁵，6^，骨矿物质密度降低，甚至^骨质疏^松症风险增加7。

矿化组织对^{骨强度非常重要}8，骨矿化基质沉积是骨形成的关键指标⁹。茜素红对钙离子具有很高的亲和力，茜素红染色是评估骨形成的标准程序¹⁰。根据这种方法，矿化组织被染成红色，而所有其他组织保持透明。然后通过数字图像分析¹¹对染色区域进行量化。

斑马鱼是一种重要的模式生物，广泛用于药物....

研究方案

此处概述的所有动物程序均已由苏州大学伦理委员会动物护理研究所审查和批准。

1. 鱼类饲养与胚胎采集 ¹⁴

1. 每天喂鱼三次;确保斑马鱼保持在28.5±0.5°C，光照/黑暗循环为14：10小时。
2. 晚上用产卵池中的隔离板将雄鱼和雌鱼分开，男女比例为2：1。
3. 第二天早上，在上午9：00移除隔离板，并在2小时后收集胚胎。
4. 在实验前将胚胎置于保持在28.5°C的生化培养箱中。

2. 化学品暴露

1. 准备母料：称取乙酸铅三水合物（5克），搅拌将其溶解在超纯水（50毫升）中。
   注意：PbAc是有毒的。戴上合适的防尘口罩、防护服和手套。在通风橱下进行实验。
2. 选择斑马鱼胚胎并将其随机分配到干净的6孔板中（在3mL斑马鱼繁殖水中每孔30个胚胎;其组成见 表1 ）。在受精后2至120小时（hpf）用PbAc（0，5，10，20mg / L）处理胚胎。
   注意：根据剂量范围查找实验选择PbAc的浓度。结果表明：在120 hpf下，斑马鱼胚胎醋酸铅的LC₅₀ 为41.044 mg/L。因此，最高浓度设置为LC₅₀ 的一半，....

结果

茜素红染色是测量斑马鱼幼虫骨矿化变化的灵敏特异方法。在这项研究中，我们观察到PbAc对斑马鱼幼虫有不利影响，包括死亡、畸形、心率下降和体长缩短。此外，还评估了斑马鱼幼虫的矿物骨骼区域，以检查PbAc诱导的骨质流失。在9 dpf（图1A）时，头部骨骼的许多骨骼被矿化，因此染成红色，例如蝶旁（PS），眼睑（OP），角分支（CB）和脊索（NC）。相比之下，耳石（OT）.......

讨论

斑马鱼是研究骨代谢疾病的合适模型。与啮齿动物模型相比，斑马鱼模型的建立速度相对较快，并且更容易测量疾病的严重程度。在野生型斑马鱼幼虫中，头部骨骼的矿化发生在5 dpf，轴骨架的矿化发生在7 dpf¹⁵。因此，颅骨如PS，OP，CB和NC在9 dpf时发育良好。幼虫完全脱色漂白后，清除软组织，使鱼体外观透明。加入茜素红染色试剂，对斑马鱼的矿骨进行染色和可视化。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)	Solarbio,Beijing,China	21	for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution	BBI,Shanghai,China	14	fixing tissues
10x PBS buffer	BBI,Shanghai,China	15	for fixing
35% H2O2	Yonghua,Jiangsu,China	8	removing pigment
50 mL Centrifuge tube	AKX,Jiangsu,China	4
95% Anhydrous ethanol	Enox,Jiangsu,China	2	destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)	Solarbio,Beijing,China	1	staining
Biochemical incubator	Yiheng,Shanghai,China	3	raising zebrafish embryos
Electronic scale	Sartorius,Germany	5	weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)	BBI,Shanghai,China	7	storing the stained fish
ImageJ (software)	USA	9	digital analysis
KOH (Purity 99.9%)	Sigma,America	10	bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)	Aladdin,Shanghai,China	11
MgCl2 (Purity 99.9%)	Aladdin,Shanghai,China	12	cleaning solution
NIS-Elements F (software)	Nikon, Japan	13	observing and taking photos
Pipe	AKX, Jiangsu, China	18	removal of embryos and solution
plates (24-well)	Corning,America	17	container for staining embryos
plates (6-well)	Corning,America	16	container for breeding embryos
Shaking table	Beyotime, China	19	mixing the solution
Stereo microscope	Nikon,Japan	20	observing and taking photos
Zebrafish	Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China	22	experimental animal