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摘要

本方案描述了一种独特的、临床相关的外周动脉疾病模型，该模型将股动脉和静脉电凝与施用一氧化氮合酶抑制剂相结合，以诱导FVB小鼠的后肢坏疽。然后，心内DiI灌注用于脚垫脉管系统的高分辨率三维成像。

摘要

外周动脉疾病 （PAD） 是慢性暴露于动脉粥样硬化危险因素导致的发病的重要原因。患有最严重形式的慢性威胁肢体缺血（CLTI）的患者面临日常生活的严重损害，包括慢性疼痛，行走距离有限而没有疼痛，以及伤口未愈合。已经开发了各种动物的临床前模型来研究PAD，但小鼠后肢缺血仍然是最广泛使用的。在这些模型中，对缺血性损伤的反应可能存在显着差异，具体取决于所使用的小鼠品系以及动脉破坏的部位，数量和手段。该协议描述了一种独特的方法，将股动脉和静脉电凝与施用一氧化氮合酶（NOS）抑制剂相结合，以可靠地诱导朋友病毒B（FVB）小鼠的脚垫坏疽，类似于CLTI的组织损失。虽然仍然推荐使用传统的评估再灌注的方法，如激光多普勒灌注成像（LDPI），但亲脂性染料1，1'-二十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基高氯吲哚花青（DiI）的心内灌注用于标记脉管系统。随后的全安装共聚焦激光扫描显微镜允许对脚垫血管网络进行高分辨率，三维（3D）重建，以补充评估后肢缺血模型中再灌注的传统方法。

引言

外周动脉疾病 （PAD） 的特征是动脉粥样硬化导致四肢血流量减少，影响美国 650 万人和全球 2 亿人1。PAD 患者的肢体功能和生活质量下降，而患有 CLTI（最严重的 PAD 形式）的患者截肢和死亡风险增加，5 年死亡率接近 50%2。在临床实践中，踝臂指数 （ABI） <0.9 的患者被认为患有 PAD，而与静息痛或组织丢失相关的 ABI <.4 的患者则认为患有 CLTI3。具有相似 ABI 的患者的症状因日活动、肌肉对缺血的耐受性、解剖学变异和侧支发育差异而异4。指和肢体坏疽是导致CLTI的所有血管闭塞性疾病的最严重表现。它是一种干燥的坏死形式，使软组织木乃伊化。除了动脉粥样硬化性 PAD 外，还可以在糖尿病患者、血管炎（如 Buerger 病和雷诺氏现象）或终末期肾病情况下的钙化反应患者中观察到该功能5，6。

已经开发了几种临床前模型来研究PAD / CLTI的发病机制并测试潜在治疗方法的疗效，其中最常见的仍然是小鼠后肢缺血。诱导小鼠后肢缺血通常是通过阻塞髂动脉或股动脉的血流来完成的，通过缝合结扎，电凝或其他收缩所需血管的方法7。这些技术大大减少了后肢的灌注，并刺激大腿和小腿肌肉的新生血管形成。然而，小鼠菌株对缺血性损伤的敏感性存在明显的应变性差异，部分原因是侧支分布的解剖学差异8，9。例如，C57BL / 6小鼠对后肢缺血相对耐药，显示肢体功能降低，但通常没有证据表明脚垫中有坏疽。另一方面，BALB / c小鼠从缺血中恢复的能力天生较差，通常在单独股动脉结扎后发生足部或小腿的自动截肢。这种对缺血的严重反应会缩小治疗窗口，并排除对肢体再灌注和功能进行纵向评估。有趣的是，位于小鼠7号染色体上的单个数量性状位点的遗传差异与C57BL / 6和BALB / c小鼠对组织坏死和肢体再灌注的这些差异易感性有关10。

与C57BL / 6和BALB / c菌株相比，FVB小鼠对单独股动脉结扎表现出中间但不一致的反应。一些动物以黑色缺血性指甲或木乃伊手指的形式出现脚垫坏疽，而另一些动物则没有任何明显的缺血迹象11。同时给予Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME），一种一氧化氮合酶（NOS）抑制剂12，可防止代偿性血管扩张机制，并进一步增加后肢组织中的氧化应激。结合股动脉结扎或凝血，这种方法在FVB小鼠中持续产生足垫组织损失，类似于CLTI的萎缩性变化，但很少进展为肢体自动截肢11。氧化应激是PAD / CLTI的标志之一，并通过内皮功能障碍和一氧化氮（NO）生物利用度降低来传播13，14。NO 是一种多能分子，通常对动脉和毛细血管血流、血小板粘附和聚集以及白细胞募集和活化发挥有益作用13。NOS水平的降低也被证明可以激活血管紧张素转换酶，从而诱导氧化应激并加速动脉粥样硬化的进展15。

一旦建立了后肢缺血的模型，还需要监测随后的肢体再灌注和任何潜在治疗的治疗效果。在提出的小鼠坏疽模型中，可以首先使用Faber评分来量化组织损失的程度，以评估足部的毛坯外观（0:正常，1-5:指甲脱落，其中评分代表受影响的指甲数量，6-10:手指萎缩，其中分数代表受影响的手指数量，11-12:部分和完全足部萎缩， 分别）9.然后通常使用LDPI进行后肢灌注的定量测量，LDPI依赖于激光和红细胞之间的多普勒相互作用来指示感兴趣区域的像素水平灌注（ROI）16。虽然这种技术是定量的，非侵入性的，并且是重复测量的理想选择，但它不能提供后肢脉管系统的颗粒解剖细节16。其他成像方式，如显微计算机断层扫描 （micro-CT）、磁共振血管造影 （MRA） 和 X 射线显微血管造影，要么成本高昂，需要复杂的仪器，要么在技术上具有挑战性16。2008年，Li等人描述了一种用亲脂性碳青染料DiI17标记视网膜内血管的技术。DiI掺入内皮细胞中，并通过直接扩散，染色血管膜结构，如血管生成芽和假足突17，18。由于其直接递送到内皮细胞和染料的高度荧光性质，该过程提供了强烈而持久的血管标记。2012年，Boden等人 通过 股动脉结扎后收获的大腿内收肌的全贴片成像，将DiI灌注技术应用于小鼠后肢缺血模型19。

目前的方法为评估后肢缺血和基于基因或细胞的治疗反应的新生血管形成提供了一种相对便宜且技术上可行的方法。在进一步的改编中，该协议描述了DiI灌注的应用，以高分辨率和3D在后肢坏疽的小鼠模型中对脚垫脉管系统进行成像。

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研究方案

协议中描述的所有动物实验均已获得迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。FVB小鼠，包括雄性和雌性，年龄在8-12周，用于研究。

1. L-NAME溶液的制备

  1. 在层流罩中的无菌条件下，通过将1gL-NAME粉末（见 材料表）与20mL无菌水溶解以制成50mg / mL溶液来制备L-NAME储备溶液。将储备溶液储存在-20°C的300-500μL等分试样中长达3个月。
  2. 要制备有效的L-NAME溶液，解冻L-NAME储备溶液的等分试样，并在无菌条件下用PBS（1:4）稀释以获得最终的10mg / mL浓度。
  3. 为了制备PBS（pH 7.4），将8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na2HPO4和0.23克NaH2PO4溶解在800毫升蒸馏水中。用HCl将pH值调节至7.4，将水加入总体积为1，000 mL，并通过0.22μm瓶顶过滤器过滤。
    注意:腹膜内（IP）注射4μL / g的L-NAME工作溶液相当于所需的40mg / kg剂量的L-NAME。L-NAME工作溶液在使用过程中应保持在冰上，并且应每天使用新鲜解冻的储备溶液等分试样进行新的稀释。

2. 后肢坏疽的化学和手术诱导

  1. 从育种者或设施内繁殖的8-12周的FVB小鼠（见 材料表）。手术前2小时，给予40mg / kg IP剂量的L-NAME。
  2. 用IP注射100mg / kg氯胺酮和10mg / kg西拉嗪（见 材料表）麻醉小鼠，稀释在PBS中。通过无脚趾捏反射来确认足够的镇静，并在手术过程中继续监测呼吸频率。
    1. 使用剪刀和/或脱毛膏去除双侧后肢和腹股沟的毛发。将动物置于手术显微镜下仰卧位;伸展并用胶带将四肢固定到位。通过将聚维酮 - 碘溶液圆周施用于手术部位来对手术区域进行灭菌。
  3. 在10-20倍放大镜下，使用剪刀或手术刀沿着腹股沟折痕做一个1厘米的切口，刚好低于腹股沟韧带。使用细镊子和无菌棉尖涂抹器，从腹股沟韧带横向钝地解剖腹股沟脂肪垫，并暴露下面的股骨鞘，以便清楚地识别股动脉，静脉和神经（图1）。
  4. 使用细镊子刺穿股鞘。小心地将股神经从股动脉刷开。确定股动脉外侧屈支（LCFA）深至股神经的起飞（图1）。
    1. 通过激活烧灼装置（ 见材料表）并以左右运动轻轻接触血管，继续对LCFA近端的股动脉和静脉进行电凝，确保股神经被很好地隔离并保持保护免受热损伤。用剪刀分割凝固的血管段。
  5. 通过内侧调动腹股沟脂肪垫，继续暴露股骨远端动脉和静脉。更远端识别浅表上腹部动脉和隐腘交界处。
    1. 刺穿这两个位置之间的股骨鞘，并小心地将股神经从股动脉血管中解剖。按照步骤2.4.1所述，继续进行股动脉和静脉的凝血和横断。
  6. 使用充满无菌PBS的注射器冲洗手术区域。通过用棉头涂抹器轻轻按压任何出血区域3-5分钟来获得止血。
    1. 使用可吸收的5-0缝合线以简单连续的方式继续闭合切口。给予1mg/kg皮下剂量的缓释丁丙诺啡（ 见材料表）以缓解术后疼痛。
  7. 通过LDPI确认结扎后肢脚垫灌注丢失（ 材料表）。在仍然麻醉时，将动物放在LDPI机器下方俯卧位置的深色泡沫垫上，并使用电工胶带环将脚固定到位。
    1. 继续使用双侧脚的LDPI。扫描完成后，在每个脚垫周围绘制ROI并获得平均通量值。
    2. 将灌注指数计算为连接脚垫与非结扎脚垫的平均通量值之比。确保灌注指数小于0.1。
  8. 将动物移回带有加热垫或顶灯的干净笼子中，以保持核心体温。在将小鼠转移回动物设施之前，确保从麻醉中完全恢复。

3. L-NAME术后给药及后肢坏死监测

  1. 在术后第1-3天，对每只动物额外给予40mg / kg IP剂量的L-NAME。同时，仔细评估足部缺血肢体。
  2. 使用Faber后肢缺血评分量化后肢缺血和坏疽的程度9。得分1-5:缺血性指甲的数量;得分6-10:1-5缺血数字;11分和12分:部分和完全足部萎缩。在术后第 1-3 天和每周记录 Faber 评分。

4. 动物灌注DII的制备及工作溶液

  1. 为了制备DiI储备溶液，将100mg DiI晶体（见 材料表）溶解在16.7mL的100%乙醇中。盖上铝箔，在室温下在黑暗中留在摇摆平台上过夜。
  2. 为了制备稀释剂，将50g葡萄糖溶解在1，000mL蒸馏水中，以产生5%葡萄糖溶液。通过0.22μm瓶顶过滤器过滤。以1:4的比例混合PBS和5%葡萄糖溶液，以制备有效的稀释剂溶液。

5. 设备设置和DiI灌注

  1. 使用前立即将200μLDiI储备溶液加入10mL工作稀释液（在步骤4.2中制备）中，制成DiI工作溶液。用手摇匀以充分混合。
  2. 串联两个或三个 3 路旋塞阀和一个 25 G 蝶针。准备10 mL注射器，4 mL PBS，10 mL DiI溶液和10 mL中性缓冲福尔马林（见 材料表）。
  3. 将带有福尔马林的注射器连接到近端流入口，并注入溶液以冲洗管路中的空气;转动旋塞阀以关闭端口。按顺序重复相同的步骤，将注射器与DiI连接，然后分别将PBS连接到中间和远端流入口，注意冲洗通过旋塞阀组件的所有气泡。
    注:确保旋塞阀组件或管道的任何部分都没有气泡。气泡在灌注过程中会阻塞小动脉，导致血管内 DiI 分布差和影像学检查结果受损。
  4. 一旦设置完成，在诱导室中通过过量的CO2 对动物实施安乐死。
  5. 将要灌注的动物以仰卧位放置在吸水垫上，并用针头固定腋窝和下肢。
  6. 使用剪刀，做一个横向切口以打开腹腔。暴露并分开左右膈肌以进入胸腔。
    1. 将胸骨两侧的胸壁从下肋骨切到第一肋骨或第二肋骨，避免内侧胸（乳腺）动脉。使用止血剂（ 材料表）抓住胸骨的下端，并将其反射到动物的头部，以暴露胸腔。
  7. 识别左心室，其颜色比右心室浅。用钝钳轻轻抓住心脏，将蝴蝶针插入左心室。
    1. 使用剪刀或18 G针刺穿右心房，让血液和灌注溶液返回心脏排出。用一只或两只手稳定针头，注意不要无意中刺穿右心室并灌注肺部而不是体循环。
  8. 用PBS打开注射器的端口，以1-2 mL / min的速度手动注射2-4 mL，持续1-2分钟，以冲洗血管系统中的血液。通过观察右心房出血确保成功灌注。注射后，关闭PBS注射器的端口。
  9. 用DiI打开注射器的端口，以1-2 mL / min的速度注射5-10 mL，持续5分钟。监测耳朵，鼻子和手掌，注射DiI溶液时应该会变成轻微的粉红色。注射后，关闭DiI注射器的端口并等待2分钟以允许在注射固定剂之前掺入染料。
  10. 用福尔马林打开注射器的端口，以1-2 mL / min的速度注射5-10 mL，持续5分钟。注射后，从左心室取出针头并继续收获感兴趣的组织。
  11. 使用沉重的剪刀，使脚踝处的胫骨脱臼，将左右脚与小腿完全分开。将收获的脚放入6孔或12孔板中，加入1-2 mL的10%福尔马林溶液。用铝箔包裹盘子，并在4°C下储存过夜。

6. 用于共聚焦激光扫描显微镜的脚垫组织的制备

  1. 第二天，用每孔1-2 mL的PBS替换6孔或12孔板中的固定溶液。
  2. 要使脚部皮肤化，首先，用手术刀在脚的足底和背侧做一个纵向切口。然后，使用齿镊子和小止血器，小心地从脚和手指上取下所有皮肤，不要损坏下面的软组织。
  3. 进行组织的安装和成像，最好在灌注和收获后的1-2天内进行。或者，将脚垫放回6孔或12孔板，并加入1-2毫升PBS;盖上铝箔，储存在4°C下，以保持荧光长达1个月。
  4. 为了安装组织，将脚分别放在两个玻璃显微镜载玻片之间，每端都有一个折叠在自身上的泡沫活检垫（一次或两次，取决于组织厚度）（ 材料表）。使用两个小的粘合剂夹将载玻片的两端压缩在一起（最终厚度约为1毫米）。
    注意:较厚的组织将需要更长的扫描时间。在成像前一天，可以在载玻片之间压缩去皮的脚垫，以减少组织厚度。

7. 共聚焦激光扫描显微镜

  1. 准备成像会话:打开成像系统并启动采集软件（请参见 材料表）。使用低放大倍率/低数值孔径物镜（例如x5/0.15）拍摄图像，因为低倍率镜头通常具有此实验所需的较长工作距离。
  2. 在"激活阶段"对话框中单击" 是 "。在"配置"选项卡中激活 561 nm 激光器。在主屏幕上，通过单击"可见"按钮激活 可见 光束路径。通过单击相应的 "活动 "复选框，将检测器设置为 570-600 nm 范围。
  3. 选择"采集>采集"选项卡中的"切片扫描"图标，然后设置所需的分辨率（512 x 512 或 1024 x 1024）。
  4. 将干燥安装（不添加水或PBS）的组织样品放置在显微镜载物台上的载玻片之间，并使组织聚焦。
  5. 要设置扫描边界，请导航到样品的左上角或右上角。在"采集"选项卡的"磁贴扫描"菜单下，单击" 标记位置 "按钮。导航到另一角（分别为右下角或左下角），然后再次单击" 标记位置 "按钮。
  6. 要设置 Z 轴堆栈的深度，请单击屏幕左下角的" 实时 "按钮，然后导航到示例的中心。使用 z 轴旋钮滚动到样品的底部。
  7. 在"获取"选项卡的"Z 堆栈"菜单下，单击" 开始 "按钮。滚动到示例的顶部，然后单击" 结束 "按钮。单击 Z 步长大小 并设置为所需值（例如，50 μm）。
  8. 在屏幕的右下角，单击" 开始" 以开始图像采集。

8. 脚垫血管的定量分析与三维重建

  1. 下载并安装最新版本的斐济（ImageJ）以及船舶分析插件20。在斐济打开显微镜图像文件，该文件将单个Z系列组合成Z轴，可以使用图像底部的滑块在z轴上查看。
  2. 选择复合 Z 堆栈图像，然后在菜单"图像"下，选择 "堆栈> Z 项目 "以创建二维投影。接下来，在"处理二进制" >"创建二进制"下的"处理>"下将 Z 投影转换为二进制投影。
  3. 在插件>血管密度下运行 血管密度插件。出现提示时，使用光标跟踪脚垫和数字周边的 ROI。记下报告的血管密度，其表示为ROI（血管面积分数）的百分比。
  4. 要在斐济创建 3D 重建，请选择"堆栈> 3D 项目"，然后在"图像"菜单下设置所需的旋转轴、角度和速度。或者，选择"插件"菜单下的"体积查看器"，将图像可视化为切片或在所需的轴上操作重建。
  5. 有关更多涉及的 3D 渲染，请使用替代图像分析和处理软件（请参见 材质表）。将文件转换为所需软件的格式，并使用拼接功能拼接单个拼接扫描件。
  6. 将单个切片扫描拼接在一起后，打开复合文件并继续进行体积曲面渲染。单击" 添加新曲面 "以打开曲面创建向导，然后使用箭头在菜单中切换，特别是设置 ROI 和阈值强度。一旦对表面渲染感到满意，利用动画功能创建处理后图像的视频。

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结果

该协议详细介绍了在易感FVB小鼠中使用股动脉和静脉凝固与L-NAME给药（一氧化氮合酶抑制剂）的组合诱导小鼠脚垫缺血和组织丢失的可靠方法。 图1 详细介绍了小鼠后肢脉管系统的解剖结构，并指示股动脉和静脉凝固的部位（黄色X），仅近端的外侧环反射股动脉（LCFA）和隐腘连接处的近端。需要确定LCFA，并且该结构的凝血位点在所有外科手术中保持一致。如前所述，在外?...

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讨论

虽然小鼠后肢缺血是研究PAD和CLTI新生血管形成的最广泛使用的临床前模型，但缺血严重程度和恢复程度存在显着差异，具体取决于所使用的特定小鼠品系以及动脉破坏的部位，数量和方法。股动脉结扎和L-NAME的IP给药相结合可以可靠地诱导FVB小鼠的后肢坏疽11。相同的治疗导致C57BL / 6小鼠的后肢缺血而没有组织损失，而在BALB / c小鼠中，足部或腿部的自动截肢可以仅由股动脉结扎...

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披露声明

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院对Z-J L和OC V的资助[R01HL149452和VITA（NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS）]的支持。我们还感谢迈阿密大学医学院迈阿密治疗瘫痪项目的显微镜和成像设施提供对其图像分析和处理软件的访问。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Binder clips (small)Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)VWR10148-584
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)InvitrogenD282
Electrocautery deviceGemini Cautery System5917
Ethanol (100%)VWR89370-084
Fiji (ImageJ) softwareNIHUsed version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy padsFisher Scientific22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%)VWR89370-094
FVB miceJackson Laboratory001800
GlucoseSigma-AldrichG7528
HCl (1 M)Sigma-Aldrich13-1700
Imaris softwareOxford InstrumentsUsed version 9.6.0.
IsofluranePivetalNDC 46066-755-04
KClSigma-AldrichP9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)Sigma-AldrichN5751
Laser Doppler perfusion imagerMoorLDImoorLDI2-HIRUsed moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)VWR48311-703
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS7653
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaOHSigma-AldrichS8263
Needles (27 G)BD305109
Povidone-iodine swabstick (10%)MedlineMDS093901ZZ
Surgical instrumentsRoboz SurgicalFine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable)DemeTECHG275017B0P
Syringes (10 mL)BD305482
Three-way stopcocksCole-Parmer19406-49
Vascular Analysis PluginFree download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine

参考文献

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181 L NAME DiI

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