使用2'，7'-二氯荧光素双乙酸探针和流式细胞术在穆勒神经胶质细胞中定量活性氧

摘要

在这里，我们提出了一种系统化，可访问和可重复的方案，以使用Müller神经胶质细胞（MGCs）中的2'，7'-二氯荧光素二乙酸探针（DCFH-DA）检测细胞活性氧（ROS）。该方法用流式细胞仪量化总细胞ROS水平。该协议非常易于使用，适用且可重复。

摘要

氧化还原平衡在维持细胞稳态方面具有重要作用。活性氧（ROS）的产生增加促进了蛋白质，脂质和DNA的修饰，最终可能导致细胞功能的改变和细胞死亡。因此，通过激活像Keap1 / Nrf2这样的抗氧化途径或通过改善氧化还原清除剂（维生素A，C和E，β胡萝卜素和多酚等）来增加其抗氧化防御能力对细胞的有害侮辱是有益的。炎症和氧化应激与视网膜病变的发病机制和进展有关，例如糖尿病视网膜病变（DR）和早产儿视网膜病变（ROP）。由于Müller神经胶质细胞（MGCs）在神经视网膜组织的稳态中起着关键作用，因此它们被认为是研究这些细胞保护机制的理想模型。从这个意义上说，用可重复和简单的方法量化ROS水平对于评估参与抗氧化细胞防御机制的途径或分子的贡献至关重要。在本文中，我们提供了使用DCFH-DA探针和MGC中的流式细胞术测量ROS所需的程序的完整描述。此处提供了使用该软件进行流式细胞术数据处理的关键步骤，因此读者将能够测量ROS水平（FITC的几何手段）并分析荧光直方图。这些工具不仅对评估细胞损伤后ROS的增加非常有帮助，而且对研究某些分子的抗氧化作用非常有帮助，这些分子可以对细胞提供保护作用。

引言

神经视网膜是一个非常有组织的组织，呈现出定义明确的神经元层。在这些中，神经元（神经节，腺素，双极，水平和光感受器细胞）彼此相互连接，并且还与Müller神经胶质细胞（MGCs）和星形胶质细胞相互连接，从而导致视觉信息的充分光转导和处理^1，2。众所周知，MGCs在维持视网膜稳态方面具有重要作用，因为它们穿过整个视网膜部分，因此，它们可以与调节多个保护过程的所有细胞类型相互作用。据报道，MGCs具有维持和存活视网膜神经元的几个重要功能，包括糖酵解为神经元提供能量，去除神经元废物，回收神经递质以及释放神经营养因子等^3，4，5。

另一方面，炎症，氧化和亚硝化应激参与许多人类疾病的发病机制和进展，包括视网膜病变^6，7，^{8，9，10，11}。细胞中的氧化还原平衡取决于ROS水平的严格调节。ROS主要是由于有氧呼吸而在生理条件下不断产生的。ROS家族的主要成员包括反应性自由基，如超氧阴离子（O_2͘͘͘͘^•−），羟基自由基（^•OH），各种过氧化物（ROOR′），氢过氧化物（ROOH）和无自由基过氧化氢（H₂O₂）^12，13。在过去的几年中，很明显，ROS通过控制基本过程在细胞中起着重要的信号作用。MGCs具有很强的抗氧化防御能力，通过激活转录核因子红系2相关因子2（Nrf2）和随后表达抗氧化蛋白以消除病理条件下ROS的过量产生^14，15，16。当细胞由于ROS的夸大产生或去除ROS的能力缺陷而失去氧化还原平衡时，氧化应激的积累会促进蛋白质，脂质和DNA的有害修饰，从而导致细胞应激或死亡。视网膜抗氧化防御系统的增加改善了视网膜病变的消退和预防，例如ROP和RD^{17，18，19，20，21，22，23，24}。因此，实时测量ROS产量是一个强大而有用的工具。

有几种方法可以测量细胞中的ROS产生或氧化应激。其中，2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针是直接量化细胞^{25，26，27，28}氧化还原状态的最广泛使用的技术之一。该探针是亲脂性的和非荧光的。该探针在细胞膜上的扩散允许其通过细胞内酯酶在两个酯键处裂解，产生相对极性和细胞膜不渗透的产物2'，7'-二氯荧光素（H₂DCF）。这种非荧光分子在细胞内积聚，随后通过ROS氧化产生高荧光产物DCF。探针的氧化是多种类型的ROS（过氧亚硝酸盐，羟基自由基，一氧化氮或过氧化物）作用的产物，可以通过流式细胞术或共聚焦显微镜（在530nm处发射并在485nm处激发）来检测。该技术的局限性在于超氧化物和过氧化氢不与H 2 DCF₂₅^，29发生强烈反应。在本文中，我们使用DCFH-DA探针通过流式细胞术测量和量化ROS。出于这个原因，我们通过用ROS诱导剂A或B刺激MGCs来诱导ROS的产生，然后再用荧光探针加载细胞。此外，我们使用抗氧化化合物。最后，我们展示了使用该协议获得的具有代表性和可靠的数据。

研究方案

注:有关缓冲液成分，请参见 表1。

1. 细胞培养制备

注意:这里描述的是MIO-M1细胞的培养制备，MIO-M1细胞是一种自发永生的人Müller神经胶质细胞系（Moorfield's/Institute of Ophthalmology-Müller 1）。始终使用适当的无菌技术，并在层流罩中工作。

1. 准备Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）完整培养基。对于含有 4.5 g/L D-葡萄糖和 110 mg/L 丙酮酸钠的 DMEM，加入 10% 热灭活 FBS、10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸 （HEPES）、2 mM L-谷氨酰胺和 50 U/mL 青霉素/链霉素。准备新鲜培养基，在MIO-M1细胞解冻的那一天。
2. 在第1天解冻冷冻的MIO-M1细胞。
   1. 为此，从液氮储存中取出含有5 x 10⁵ MIO-M1细胞的冷冻管，在FBS中含有10%DMSO，并立即将其放入37°C水浴中。
      注意:始终佩戴口罩或安全护目镜，因为储存在液氮中的冷冻管在解冻时存在爆炸风险。
   2. 通过在37°C水浴中加热小瓶来快速解冻MIO-M1细胞（在不到1分钟的时间内），直到小瓶中只剩下一小块冰。
   3. 用70%乙醇擦拭小瓶的外部，并将其转移到层流罩中。
   4. 将解冻的细胞从小瓶转移到无菌的15 mL管中，然后滴加6 mL预热的完整DMEM培养基。
   5. 将细胞悬浮液以约600× g 离心5分钟。离心后，将可视化透明的上清液和完整的沉淀。用移液管丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀。
   6. 轻轻解离沉淀并将细胞重悬于10mL完整的DMEM培养基中。将该细胞悬浮液转移到直径为100mm的组织培养板中，并在37°C，5%CO 2下将板孵育约₂天。
3. 当MIO-M1细胞在第4天汇合80%-90%时，执行以下步骤。
   1. 将板从培养箱转移到层流罩中。小心地除去上清液，并用5毫升无菌和预热的PBS洗涤2次。吸出PBS。
   2. 分配1mL0.5%胰蛋白酶- EDTA溶液，并在CO₂培养箱中在37°C下孵育3-5分钟以分离细胞。
   3. 加入7 mL完整的DMEM培养基以抑制胰蛋白酶的作用。通过缓慢上下移液（P1000）来分解聚集的簇状胰蛋白酶消化的MGCs。将细胞悬浮液收集在15 mL管中。
   4. 以600× g 离心5分钟。弃去上清液。轻轻地将细胞沉淀重悬于2 mL完整的DMEM培养基中。将1 mL该细胞悬浮液转移到含有9 mL预热的完整DMEM培养基的100 mm板中。
   5. 用另一个100毫米的板重复该动作。将板在37°C下在5%CO 2培养箱中孵育约₁天。
4. 当两个板都汇合80%-90%时（在第6天），将板转移到层流罩中。按照步骤 1.3 操作。以获得细胞沉淀。
5. 轻轻解离沉淀并将细胞重悬于5 mL完整的DMEM培养基中。使用血细胞计数器（Neubauer室）和台盼蓝溶液按照以下步骤计数MIO-M1细胞。
   1. 将玻璃盖放在Neubauer室中央区域。将腔室放在平坦的表面上（例如，工作台或工作台）。
   2. 将等体积的台盼蓝染色剂与细胞混合。例如，将60μL台盼蓝与60μL细胞混合，进行1:2稀释。
   3. 从该混合物中，将10μL微量移液管加载到Neubauer室中。
   4. 将加载的Neubauer室放在显微镜载物台上。然后，打开灯并调整亮度。
   5. 将显微镜载物台移动到最佳位置并调整焦点，直到获得细胞的清晰图像。
   6. 计数位于血细胞计数器角落的四个正方形（细分为16）内的细胞（体积:每个0.1mm³ ）。
   7. 使用以下公式计算细胞浓度。
      浓度 =（细胞数 x 10.000）/平方数
      浓度 =（细胞数 x 10.000）/4
      浓度 = 细胞数 x 2500
      注意:如果进行细胞稀释，则获得的浓度应转换为稀释前的原始浓度。
      浓度 =（细胞数 x 2500 x 2） = （细胞数 x 5000 个细胞/mL）
   8. 在完整的DMEM培养基中将细胞悬浮液调节至1 x 10⁵ 个细胞/ mL，并将该细胞悬浮液的2 mL板放入6孔板（2 x 10⁵个细胞/孔）中。轻轻摇动平板以均匀分布细胞。将6孔板在37°C下在5%CO₂培养箱中孵育过夜。

2. 分析条件和对照

1. 为每个实验包括以下实验对照:
   1. 自动荧光控制（没有DCFH-DA探针的细胞，用于设置流式细胞仪参数的控制）。
   2. 基础控制（未受刺激的细胞）。
   3. 阳性对照（用ROS诱导剂A或B处理的细胞）。
   4. 阴性对照（用抗氧化化合物处理的细胞）
   5. 样品（用抗氧化化合物和ROS诱导剂处理的细胞，A或B）。

3. 进行测定

注意:测定在第7天进行。除非另有说明，否则始终使用适当的无菌技术并在层流罩中工作。

1. 准备低血清 DMEM。补充含有 4.5 g/L D-葡萄糖和 110 mg/L 丙酮酸钠的 DMEM，含 0.5% 热灭活 FBS、10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺和 50 U/mL 青霉素/链霉素。在MIO-M1处理当天准备新鲜培养基。
2. 将6孔板（60%-70%汇合）从培养箱转移到层流罩中。吸出上清液并用PBS洗涤细胞1倍。每孔加入2mL低血清DMEM，并将6孔板在37°C，5%CO 2下孵育₂小时。这样做是为了使细胞挨饿。
3. 血清饥饿后，用抗氧化化合物处理细胞6小时。
   1. 吸出上清液并将2mL稀释的原液加入以下条件下:阴性对照（用抗氧化化合物处理的细胞）和样品（用抗氧化化合物和ROS诱导剂处理的细胞，A或B）。
   2. 将6孔板在37°C，5%CO 2下孵_育6小时。
      注意:如果使用另一种抗氧化化合物或ROS抑制剂，请标准化刺激的最佳时间和浓度。
4. 孵育6小时后，用ROS诱导剂A或B处理细胞30分钟。
   1. 将刺激物添加到以下条件下:阳性对照（用ROS诱导剂处理的细胞，A或B）和样品孔（用抗氧化剂化合物和ROS诱导剂处理的细胞，A或B）。
      注意:将储备溶液保存在冰上。
   2. 将6孔板在37°C，5%CO₂下孵育30分钟。
      注意:如果使用另一种ROS诱导剂，请正确标准化刺激的最佳时间和浓度。
5. 使用DCFH-DA探头加载电池。
   1. 吸出上清液并用PBS洗涤6孔板中的细胞3x以除去所有刺激。
   2. 关闭层流罩的灯，在黑暗中工作。制备稀释的1:1000的5mM DCFH-DA探针储备溶液，以在15mL管中获得DMEM中终浓度为5μM DCFH-DA的无酚红。
   3. 使用涡旋轻轻混合，并将1mL该溶液加入以下孔中:基础对照（未刺激的细胞），阳性对照（用ROS诱导剂处理的细胞），阴性对照（用抗氧化化合物处理的细胞）和样品孔（用抗氧化化合物处理的细胞和ROS诱导剂，A或B）。
   4. 向自发荧光对照细胞中加入1 mL不含酚红的DMEM。
   5. 将6孔板在37°C，5%CO₂下孵育30分钟。
      注:探头对光敏感。丢弃所有未使用的探头溶液。

4. 流式细胞术的细胞制备

1. 6小时后，将板放在冰上。从这一步开始，没有必要使用适当的无菌技术并在层流罩中工作。
2. 每孔用2mL冷PBS洗涤细胞3次。向每个孔中加入0.5 mL冷分离缓冲液。通过使用P1000移液器轻轻地上下移液来收获细胞。
3. 将它们收集在标记的1.5mL管中，并在4°C下以600× g 离心5分钟。
   注意:收获细胞时，通过将P1000移液器设置为0.4 mL来避免气泡形成。从这一步开始，快速工作。
4. 离心结束后，将标记的1.5 mL管与细胞放在冰上。小心地丢弃上清液，轻轻地用敲击解离细胞沉淀。
5. 向每个标记的1.5mL管中加入1mL FACS缓冲液以洗涤细胞。如有必要，使用最低强度的涡旋以完全解离细胞沉淀。在4°C下以600× g 离心5分钟。 重复这些步骤 2 倍以上。（总共进行三次洗涤）。
6. 当最后一次洗涤结束时，标记5 mL圆底聚苯乙烯管（流式细胞术管）用于所有实验条件（参见步骤2）。
7. 当离心结束时，将细胞沉淀重悬于200μLFACS缓冲液中。通过使用涡流轻轻解离每个1.5 mL管中的沉淀。转移到标记的5 mL圆底管中。将试管保持在冰上，直到在流式细胞仪上进行分析。

5. 流式细胞仪中的数据采集

1. 使用流式细胞术软件，创建一个新的实验。为此，请在菜单栏中转到" 实验 "，然后单击" 新建实验 "（Ctrl+E）。
2. 此外，在菜单栏中，转到" 查看 "并单击以下选项: 工具栏、 状态栏、 浏览器、 细胞仪、 检查器、 工作表、 采集仪表板 和 双指数编辑器 ，以查看工作区中的这些窗口。
3. 在软件左侧，单击 Specimen_001 。这将打开一个管列表（Tube_001，Tube_002等）。要为对照和不同的实验条件标记试管，请双击 Tube_001，Tube_002等，然后重命名它们（请参阅步骤2）。
4. 从实验的 细胞仪设置 中选择第一个试管中要分析的通道/参数（FSC，SSC，FITC和APC或任何其他荧光染料以查看象限）。
5. 单击" 当前管指针 "图标以选择管子，图标将变为绿色。将"自动荧光控制"管放在吸气臂上，仅向左小心地移动底座。
   1. 要运行"自动荧光控制"样品，请转到"采集仪表板"窗口，然后单击" 采集数据"。打开 FSC（在 x 轴上）与 SSC（在 y 轴上）的点图。
   2. 快速调整正向和侧向散射电压，以确保事件出现在图形上。在"采集仪表板"窗口中，单击" 停止采集"。在本实验中，使用以下电压设置:FSC - 200 V，SSC - 423 V。
6. 要设置FITC电压，请运行"阳性对照（用ROS感应器A或B处理的电池）"。调整电压，使所有事件都显示在 FITC 的直方图上。在这种情况下，请使用280 V的电压。在〖采集仪表板〗窗口中，单击停止 采集。
7. 再次将"自动荧光控制"管放在吸气臂上。在"采集仪表板"窗口中，单击" 采集数据"，然后单击" 记录数据"，然后选择所需的停止条件（例如，50，000 个事件）。在感兴趣的细胞周围画一个门，排除死细胞和碎片。
   注意:观察到的事件比主细胞群小得多，并显示在图的左下角。
8. 采集结束后，从吸气臂上取下管子。设备将自行清洗。在"采集仪表板"窗口中，单击" 下一管 "并运行 基础控件（未刺激的单元格）。单击" 获取数据" ，然后单击" 记录数据"。
   1. 从初始门（排除死细胞和碎片的门）开始，创建另一个FITC（在x轴上）与APC（在y轴上）的点图。绘制象限门并调整坐标，以便可视化 FITC 与 APC 图左下象限上的事件。
9. 要记录下一个样品，请取出试管，然后单击 下一个试管>采集数据>记录数据。
   注意:此处使用的流式细胞仪（参见 材料表）每个管最多记录1 x 10⁶ 个事件。
10. 当所有电子管的记录结束时，将数据导出到磁盘D。为此，请单击" 文件>导出> FCS 文件">选择 3.0 或 3.1 版本。
    注:虽然本方案中详细介绍了使用一个软件（参见 材料表）进行数据采集，但也可以使用任何其他流式细胞术软件。采集参数（FSC、SSC 和 FITC）可以以相同的方式设置以获得结果。

6. 采集数据分析

1. 打开软件并使用"添加示例"操作按钮 添加示例 ;它位于任务栏或导航波段。
   1. 单击" 添加示例"。
   2. 使用文件浏览器，导航到"实验"文件夹。
   3. 选择"实验性"文件夹，然后单击" 选择"。
      注意:示例文件作为"所有示例"组的一部分加载到工作区中。
2. 双击工作区中的第一个样品: 自动荧光控制。
   注意:此操作将打开一个"图形"窗口，其中沿前向散射（x 轴上的 FSC-A）参数与侧散射（y 轴上的 SSC-A）参数绘制事件。
3. 绘制多边形门以分离感兴趣的细胞，排除死细胞和碎片。
   1. 单击 面门 工具。
   2. 在图中单击以组成多边形门。根据需要制作尽可能多的面。
   3. 在最后一个点双击以关闭面并创建所需的门。
   4. 为门提供一个名称，例如"MIO-M1 单元"，然后按"确定"。
      注意:将出现一个新的图形绘图窗口，仅显示 MIO-M1 事件，没有死细胞和碎屑。
   5. 对所有要分析的样品重复上述步骤。
4. 将绘图更改为直方图。为此，请单击 X 轴参数标签 ，然后选择 FITC-A。单击 Y 轴参数标签 ，然后选择 直方图。这会将绘图更改为一维直方图。
5. 使用添加统计数据 窗口添加统计数据。
   1. 在直方图下方，单击 添加统计数据。程序将打开一个新的统计窗口。
   2. 在新窗口的左侧选择统计数据 几何平均值。
   3. 选择 群体 MIO-M 1 单元格。
   4. 从可用参数列表中，选择 FIT-C。
   5. 单击 添加 按钮将其应用于分析。
      注意:这将在样本门控树中创建新的统计数据"几何平均值:FITC"，其值将显示在工作区中。
6. 将这些几何平均值放入统计程序中并进行分析。
7. 单击 L图标 以打开布局编辑器;此图标位于工作区的 "菜单"选项卡 中。将"工作区"窗口和"布局编辑器"并排放置。
   注意:布局编辑器是一个单独的工作区窗口，其中包含用于在简单图形报告中显示多个图形绘图和统计信息的工具。这可以与您喜欢的扩展文件一起导出，例如PDF或JPG等。
   1. 从"工作区"窗口中示例的门控树中，将 MIO-M 1 单元格群 拖到布局编辑器中。
   2. 确保在布局编辑器中显示包含门中事件的直方图。其他基本信息将在下面的文本框中详细说明。
   3. 拖动所有样本以在同一图形中进行比较。该计划将重叠它们。
   4. 右键单击直方图，然后选择 "属性"。程序将打开一个新的图形定义窗口。此窗口有四个选项卡（"注释"、"字体"、"图例"和"指定"）。 单击指定 选项卡，然后将 y 轴从"自动"更改为"模式"。单击" 应用"。
   5. 右键单击示例并更改"颜色"、"线条样式"、"线条粗细"等以个性化图形。
   6. 要导出图像，请单击文件选项卡，然后立即在文档波段中选择 保存图像 。选择首选类型的图像文件（例如，PDF）。
      注意:将打开一个保存对话框，提示您选择保存位置。点击 保存。
8. 将分析另存为工作区 （.wsp） 文件。
   1. 在左上角，单击 细胞术分析图标， 然后选择 另存为。
   2. 选择 另存为工作区 （WSP） 以保存包含数据和分析的文档。
   3. 输入工作区文件的名称。
   4. 点击 保存。

结果

如方案部分所述，我们已经展示了具有代表性和定量的数据，这些数据证明了流式细胞术检测荧光探针DCFH-DA从用ROS诱导剂A或B刺激的MIO-M1细胞中产生ROS。正如预期的那样，我们观察到未受刺激细胞中FITC荧光的变化高于自发荧光水平（图1A，比较"基础对照"与"自发荧光对照"，点图）。这是由于MIO-M1细胞中ROS的基础产生而发生的。（图1B，比较"基础控制"?...

讨论

几种病理状况，如癌症，炎症性疾病，缺血/再灌注，缺血性心脏病，糖尿病和视网膜病变，以及衰老等生理状况，导致ROS生产过剩^{6，7，8，9，10，11}。因此，检测、测量和了解ROS调节所涉及的途径是许多疾病的重要靶点。使用探针测量ROS水平，如DCF...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-DCFH-DA	Sigma	35845-1G
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco by life technologies	15630-080
BD FACSCanto II flow cytometer	BD Biosciences	FACSCanto
BD FACSDiva software	BD Biosciences
Cell Culture Dishes 100x20 mm	Cell Star- Greiner Bio-One	664 160
Centrifuge	Thermo	Sorvall legend micro 17 R
Centrifuge Tubes (15 ml)	BIOFIL	CFT011150
Centrifuge Tubes (50 ml)	BIOFIL	CFT011500
Cryovial	CRYO.S - Greiner Bio-One	126263
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387520-1KG
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate	Merck	106575
DMEM without phenol red	Gibco by life technologies	31053-028
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco by life technologies	11995065
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate	Merck	324503
Fetal Bovine Serum	Internegocios
FlowJo v10 Software	BD Biosciences
Glucose	Merck	108337
hemocytometer, Neubauer chamber	BOECO,Germany
Laminar flow hood	ESCO	AC2-6E8
L-glutamine (GlutaMAX)	Gibco by life technologies	A12860-01
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Penicillin/Streptomycin	Gibco by life technologies	15140-122
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	4878
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)	Falcon - Corning	BD-352008
Sodium Azide	Merck	822335
Sodium Chloride	Merck	106404
Sodium Hydroxide	Merck	106462
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml	Tarson	500010-N
Tissue Culture Plate 6 well	BIOFIL	TCP011006
Trypan Blue	Merck	111732
Trypsin-EDTA 0.5% 10X	Gibco by life technologies	15400-054
Vortex Mixer	Labnet International, Inc.