新生儿鼠心在朗根多夫制剂中的应用改良技术

摘要

本方案描述了新生儿鼠心脏的体 外 旋插管和逆行灌注。 使用解剖显微镜和钝化的小针头的两人策略允许可靠的插管。纵向收缩张力的量化是使用连接到左心室顶点的力传感器实现的。

摘要

自一个多世纪前Oskar Langendorff开发 以来，使用离体 逆行灌注心脏长期以来一直是缺血再灌注研究的基石。 尽管该技术在过去25年中已应用于小鼠，但其在该物种中的使用仅限于成年动物。开发一种成功的方法以始终如一地对新生儿鼠主动脉进行插管，将允许在遗传可改变和低成本物种的心脏发育的关键时期对孤立的逆行灌注心脏进行系统研究。对朗根多夫制剂的修饰能够在新生儿鼠心脏中进行插管和再灌注，同时最大限度地减少缺血时间。 优化需要两人技术，以允许使用解剖显微镜和改良的市售针头成功插管新生小鼠主动脉。 使用这种方法将在3分钟内可靠地建立逆行灌注。由于新生儿小鼠心脏和心室腔大小的脆弱性阻止了使用球囊产生的脑室内压力的直接测量，因此有必要使用通过缝合线连接到左心室顶点的力传感器来量化纵向收缩张力。这种方法使研究人员能够成功地建立一种孤立的恒流逆行灌注新生儿鼠心脏制剂，从而能够以 离体 方式研究发育性心脏生物学。重要的是，该模型将成为研究新生儿心脏缺血再灌注的生理和药理反应的有力工具。

引言

一个多世纪以来，离体心脏制剂一直是生理学、病理生理学和药物学研究的主要内容。源于19世纪60年代Elias Cyon的工作，Oskar Langendorff将分离的青蛙模型用于逆行灌注，加压主动脉根部以提供带氧灌注的冠状动脉流动¹。利用他的适应，朗根多夫能够证明冠状动脉循环与机械功能²之间的相关性。离体逆行灌注心脏，后来同名地被称为朗根多夫技术，仍然是生理学研究的基石，利用其简单性在没有潜在混杂物的情况下有力地研究了孤立的心脏。Langendorff制剂已被进一步修改，以允许心脏弹出（所谓的"工作心脏"）并允许灌注物再循环³。然而，感兴趣的主要生理终点保持不变。这些终点包括收缩功能、电传导、心脏代谢和冠状动脉阻力^{的测量 4}。

为了评估他最初的青蛙心脏准备中的心脏功能，Langendorff使用连接在心脏顶点和力传感器之间的缝合线测量了纵轴心室收缩产生的张力。⁵ 等距收缩以这种方式量化，在没有心室充盈的情况下将基础张力施加到心脏上。该方法的改进导致 通过 左心房将充满液体的球囊放入左心室，以评估等值宫收缩期间的心肌表现⁶。为了评估心律和心率，可以在心脏的两极上放置表面导线，以使研究人员能够记录心电图。然而，鉴于强制性去神经支配，相对心动过缓是可以预期的。外在起搏可能有助于克服这一点并消除实验¹之间的心率变异性。另一个结果测量，心肌代谢，可以通过测量冠状动脉灌注物和流出物中的氧和代谢底物含量并计算它们之间的差异来评估⁷。冠状动脉流出物中的乳酸定量有助于表征厌氧代谢期，如缺氧、低灌注、缺血再灌注或代谢紊乱^{所示 7}.

Langendorff的原创工作使研究体外哺乳动物心脏成为可能，以猫为主要受试者⁵。对孤立大鼠心脏的评估在1900年代中期随着霍华德·摩根（Howard Morgan）的普及而流行，他在1967年详细介绍了"工作心脏"大鼠模型⁵。小鼠的使用仅在25年前开始，由于技术复杂性，组织脆弱性和相对较小的鼠心脏尺寸。尽管存在与小鼠研究相关的挑战，但遗传操作的较低成本和易用性增加了这种小鼠离体制剂的吸引力和需求。不幸的是，该技术的应用仅限于成年动物，直到最近，4周龄的幼年小鼠才成为用于离体研究的最年轻的受试者^8，9。虽然与成年小鼠相比，幼年小鼠"相对不成熟"，但它们作为发育生物学研究对象的效用有限，因为它们基本上已经从出生母亲那里断奶，很快就会开始青春期¹⁰。青春期发生在心肌底物利用从葡萄糖和乳酸盐到脂肪酸¹¹的产后过渡之后。因此，关于新生儿心脏代谢变化的大多数信息历来来自较大物种（如兔子和豚鼠¹¹）的离体工作。

事实上，存在朗根多夫准备的替代方法。这些包括缺乏整个器官功能数据和背景的 体外 实验，或 体内 研究。这在技术上可能具有挑战性，并且由于混淆变量而变得复杂，例如必需麻醉剂的心血管和呼吸系统效应，神经体液输入的影响，核心温度的后果，动物的营养状况以及底物可用性^12，13。由于朗根多夫方法允许在没有这种混杂物的情况下以更可控的方式以离 体 方式研究分离灌注心脏，因此它一直并将继续被认为是一种强大的研究工具。因此，这里介绍的技术为研究人员提供了一种用于新生儿鼠心脏体 外 研究的实验方法，并限制了再灌注的时间。

鉴于心肌成熟期间发生的广泛的生化、生理和解剖转变，在发育期间检查心脏是一个重要的考虑因素。从厌氧代谢到氧化磷酸化的转变，底物利用的变化以及从细胞增殖到肥厚的进展是未成熟心脏中独特发生的动态过程^11，14。心脏发育的另一个关键方面是，在必要时期遇到的压力源可能会在新生儿心脏中产生更高的反应，并改变未来在成年期对侮辱的易感性¹⁵。尽管先前的工作已经利用新生大鼠，羔羊和兔子来研究朗根多夫灌注的新生儿心脏，但鉴于该物种对发育生物学研究的重要性，允许小鼠使用的进步是必要的¹⁶。为了满足这一需求，最近建立了第一个使用10天大动物的小鼠Langendorff灌注新生儿心脏模型⁶。这里介绍的是一种能够成功进行主动脉插管并建立孤立的新生儿鼠心脏逆行灌注的方法。这种方法可用于药理学、缺血再灌注或专注于整个器官功能的代谢研究，或者可用于心肌细胞的分离。

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研究方案

哥伦比亚大学医学中心的机构动物护理和使用委员会对所有描述的方法都获得了批准。野生型C57Bl / 6雄性产后第10天小鼠用于研究。

1. 朗根多夫仪器的制备

1. 为了最大限度地降低复杂性，请在朗根多夫装置内通过恒定流量或恒定压力使用非再循环含氧灌注液（参见材料表）。
   1. 使用克雷布斯-亨赛莱特缓冲液（KHB），其中含有120毫摩尔/升的NaCl，4.7毫摩尔/升的KCl，1.2毫摩尔/升的MgSO₄，1.2毫摩尔/升的KH₂PO₄，1.25毫摩尔/升的氯化钙₂，25毫摩尔/升的NaHCO₃和11毫摩尔/升的葡萄糖，pH 7.4（见 材料表），在朗根多夫装置内与95%的O₂ 和5%的CO₂ 平衡并保持在37°C。
2. 对于恒流方法，将连续流速保持在~2.5 mL∙^min-1。
   注意:该流速将接近约75-80 mL / g∙min的冠状动脉流量，因为10天龄（P10）小鼠心脏的平均重量约为〜30mg^17，18。

2. 主动脉套管的制造

1. 用26 G不锈钢针头制造新生小鼠主动脉套管（见 材料表）。用锋利的剪刀，切掉针尖，使末端变钝。注意不要压接或限制针腔的直径。平滑切割边缘，并使用来回运动在实验室台面上轻轻刮削钝端，并清除任何毛刺。
   注意:必须去除微小的毛刺和锋利的边缘，因为它们会撕裂新生小鼠主动脉并损坏主动脉瓣。或者，使用细粒度砂纸。
2. 将制造的套管连接到朗根多夫装置上，并评估流动和阻力。通过收集和测量已知时间段内的缓冲液量来测量通过套管的流速。确保实际流量等于设定的 2.5 mL 最小 ¹ 流速。
3. 按照以下步骤量化KHB流动的套管上的压差。
   1. 在连接和不连接预制套管的情况下测量系统中的压力。
   2. 根据欧姆定律¹⁵，将套管上的压差除以流速，以获得套管阻力。
   3. 确保所制备的套管电阻包含~16.0±1.9 mmHg∙min∙^mL-1 的总电阻⁶。过度耐药提示套管腔可能受损。
      注:样品计算:_带套管 的P - _{不带套管的} P = ΔP。如果 P_带 = 48，P_不带 = 8，则 ΔP = 40。当流速 （Q） 为 2.5 mL ^min-1 和 ΔP 为 40 时，套管电阻等于 16 mmHg∙min∙^mL-1 ，使用 R = ΔP/Q = 40 / 2.5 = 16。
4. 取下26 G套管并将高压管（见 材料表）连接到朗根多夫设备上的插管部位。将主动脉套管连接到导管的远端。用含氧缓冲液对管道和套管进行脱气，确保去除所有气泡。
   注意:以这种方式使用高压管允许套管延伸到更远的位置。这对于允许使用与设置相邻的解剖显微镜进行主动脉插孔是必要的（图1）。

3. 器官摘取

1. 通过腹腔（IP）注射肝素（10 kU / kg）（参见材料表）来抗凝小鼠，以防止在1mL注射器上使用26G针头形成冠状动脉微血栓。在继续注射任何麻醉剂之前，等待几分钟让肝素循环。
2. 在1 mL注射器上使用26 G针头进行IP注射麻醉动物。
   注意:麻醉注射后必须仔细监测动物，以避免呼吸暂停和随后的缺氧。戊巴比妥（70 mg/kg）是一种可靠的麻醉剂选择，因为它可以快速起效镇静，而不会诱发呼吸暂停^19，20。可以使用其他麻醉剂，前提是使用的剂量不会引起呼吸暂停²¹。研究人员应考虑替代镇静催眠药对心脏功能的影响^22，23。宫颈脱位作为安乐死的主要模式可能会延长插管前缺氧和缺血。
3. 将鼠标置于仰卧位，并在失去意识后立即固定四肢。使用小号皮下注射针头固定每个肢体。一旦动物对脚趾捏不动，就开始收获;动物在初始解剖期间应自发呼吸。
4. 在动物的宽度上做一个横向的亚氧面切口，用直的解剖剪刀露出腹腔（见 材料表）。
   注意:无菌技术不是必需的，因为该手术代表非呼吸手术。
   1. 识别上部隔膜并完全切开前部。沿腋窝中线沿头颅方向双侧切开胸腔。要求助手用镊子掌握剑突，并将胸骨和肋骨颅反射，以暴露胸部器官。
5. 识别肝脏上方的膈肌下腔静脉 （IVC）。用弯曲的虹膜剪刀横切IVC，同时用虹膜镊子在近端节段上保持轻微的前部和头颅张力（参见 材料表）。
   1. 使用弯曲的虹膜剪刀沿脊柱前表面向后切开，同时将IVC向上拉出胸腔。当心脏被动员时，将剪刀向前倾斜，并上部切断大血管以完全切除心脏和肺部。
      注意:这种方法允许心脏和肺部的整体快速外植 。
6. 立即将标本浸没在冰冷的KHB或盐水中。心脏应在几秒钟内停止跳动。

4. 插管

1. 切一张纸巾，放在浅培养皿的底部，以提供摩擦力，在插管期间稳定心脏。用冰冷的KHB润湿，以防止心脏粘附在它上面。
   1. 将准备好的培养皿置于解剖显微镜下并调整焦点。将连接到高压延长管的主动脉套管置于解剖显微镜下，并在其轮毂周围松散地系上5-0丝缝合线（参见 材料表）。
      注意:必须注意限制培养皿中的液体量，因为充满空气的肺部可以漂浮并导致切除的器官移动。
2. 将切除的胸部器官放入培养皿中。在显微镜下，通过其白色光泽和两个裂片识别胸腺，并将标本定向，使胸腺位于前部和上^部24。这将确保心脏的正确方向。
3. 使用镊子，钝地分离胸腺的裂片以暴露大血管。通过定位主动脉弓的区别性分支特征来识别主动脉。
   注意:深紫色色调通常标定右心室和肺动脉。升主动脉位于肺主动脉和右心房之间。
4. 用细尖的剪刀切开主动脉（见 材料表），正好在锁骨下动脉起飞的近端。
   注意:如果主动脉瓣太靠近主动脉瓣，则没有足够的主动脉组织来固定套管。或者，如果主动脉切开得太高，灌注物可以从一个或多个主动脉分支（如锁骨下动脉）泄漏出来。
5. 使用珠宝商风格的精细弯曲镊子轻轻抓住横切的主动脉（见 材料表）。用26 G钝针小心地卡住主动脉，注意不要损坏主动脉瓣。用套管周围细小弯曲的镊子抓住主动脉，以保持到位。一旦主动脉得到控制，开始逆行灌注以限制缺血时间。
   注意:心脏应该开始跳动，并且随着血液从心肌排出并且KHB灌注冠状动脉，心脏会变得苍白。自发跳动失败、存在心室肿胀或心脏无颜色变化提示插管位置不当。
6. 让助手抓住松散捆绑的缝合线的末端，小心地将主动脉缠绕在套管周围。根据主动脉组织的数量和解剖学方面的考虑，在弯曲的细镊子上方或下方（将套管固定到位）上或下方夹紧缝合线。收紧缝合线并确认冠状动脉血流是否充足。
7. 将高压管与朗根多夫设备断开连接。抓住套管的轮毂，断开钝针与高压延长管的连接。迅速将套管的轮毂连接到设备上。
   注意:必须注意不要移开心脏或将空气吸入套管。
8. 一旦心脏以通常的位置悬挂在朗根多夫器械上，并确认足够的灌注，请仔细修剪肺，胸腺和多余的组织。切开右心房，使冠状动脉窦流出物自由滴落。

5. 功能测量

1. 在5-0丝缝线的末端打一个小结（连接到弯曲的针上）。用针刺穿一小块石蜡膜（2-3毫米x 2-3毫米），并将石蜡滑到打结的末端。小心地将针穿过心室的顶端，并将缝合线拉过心脏，直到石蜡膜紧贴心室的侧壁。
   注意:石蜡膜有助于防止结撕裂心脏和拉过心室。
2. 将针穿过朗根多夫装置充满水的保暖夹克的开口。心脏现在可以被包裹和温暖。
3. 将针头连接到力传感器（见 材料表）上，以避免冠状动脉窦滴漏。调整缝合线以施加1-2g的基础张力，如张力示踪中的舒张张力或最低点所示。
   注意:避免将心脏从套管上拉下或扭转主动脉，从而影响冠状动脉灌注。
4. 将表面电极放在心脏的上下极上，以记录心电图。
   注意:使用儿科临时心外膜起搏丝，取出针头，以获得连接到Bio Amp的柔性表面电极（参见 材料表）。
5. 使用24 G静脉导管对冠状动脉窦流出物进行取样进行分析（参见 材料表）。
6. 根据基尔霍夫定律²⁵，从总系统电阻中减去套管阻力，以获得冠状动脉阻力。

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结果

P10小鼠用于模拟人类婴儿期的时间点^26，27。15个分离的C57Bl / 6新生小鼠心脏被收获并成功插管。心脏灌注2.5 mL ^min-1 的加热含氧KHB的连续流动。测量代谢参数，包括葡萄糖提取，氧气消耗，乳酸产生以及心率，灌注压力和冠状动脉阻力等生理参数。使用表面电极记录连续心电图，从而可以确定内在心率和节律（图2）。纵轴?...

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讨论

本工作描述了分离的新生儿小鼠心脏中成功的主动脉插管和逆行灌注。重要的是，它使研究人员能够克服年轻鼠龄和小心脏尺寸先前提出的障碍⁸。虽然在设计上并不复杂，但这种方法确实需要相当程度的技术技能。即使是技术最熟练的研究者，也不可避免地会面临挑战的关键步骤将是主动脉插管和将套管固定到位。新生儿插管困难不仅仅是由于主动脉腔体积小。升主动脉（主动...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A