原发性恶性胸膜间皮瘤肿瘤系的生成和扩展

摘要

本方法论文的目的是证明一种可靠且可重复的方法，用于从手术切除的胸膜间皮瘤中富集，生成和扩增原发性肿瘤细胞系。

摘要

目前缺乏从罕见肿瘤类型中扩展原发性肿瘤细胞系的方法。该协议描述了通过提供从消化到富集，扩增，冷冻保存和表型表征的过程的完整概述，从手术切除的恶性胸膜间皮瘤（MPM）中扩展原代肿瘤细胞的方法。此外，该方案引入了肿瘤生成的概念，这些概念可能对多种肿瘤类型有用，例如差异胰蛋白酶消化和解离方法对细胞表面标志物检测的影响，以进行表型表征。这项研究的主要局限性是选择将在二维（2D）培养系统中扩展的肿瘤细胞。该方案的变体，包括三维（3D）培养系统，培养基补充剂，改善附着力的板涂层以及替代的分解方法，可以提高该技术和建立肿瘤谱系的整体成功率。总体而言，该方案为从这种罕见的肿瘤中建立和表征肿瘤细胞提供了一种基础方法。

引言

恶性胸膜间皮瘤（MPM）是一种与石棉暴露高度相关的罕见肿瘤。尽管基于免疫疗法的方法显示出令人鼓舞的结果，但发生这种疾病的患者缺乏可用的治疗方案，并且总体5年生存率很低^1，2。多个机构正在努力更好地了解这种疾病，并确定可能改善患者预后的新治疗靶点。虽然有多个间皮瘤小鼠模型，但对原发性间皮瘤肿瘤细胞的获取更为有限³.原发性间皮瘤肿瘤细胞的 体外 扩增将提供一个有价值的模型系统，可用于直接研究肿瘤细胞及其与肿瘤浸润淋巴细胞等自体免疫细胞的相互作用。虽然有关于原发性间皮瘤肿瘤细胞系扩增的报道，但这些报道很少，并且没有提供详细的标准操作程序（SOP）。此外，很少有细胞系可以从商业来源获得，如美国型培养物收集（ATCC）。虽然原发性肿瘤系的可用性有限，但已经证明肿瘤细胞可以从胸腔积液中扩展并直接从肿瘤组织中扩展^4，5。此外，扩增的肿瘤细胞系已被证明可以保留原始肿瘤^4，5，6的分子谱。

我们的实验室正在研究MPM的肿瘤免疫微环境，并开发了一种从手术切除病例中扩增原发性MPM肿瘤细胞系的方法。该方法改编自我们在建立原发性转移性黑色素瘤肿瘤细胞系方面的经验。这项工作的目标是使用2D模型系统和随后的表型分析，为原发性间皮瘤肿瘤谱系扩展提供一种详细，实用的方法。鉴于最近靶向CTLA4和PD-1的检查点阻断策略在一线^组2中取得了成功，产生许多原发性肿瘤系的能力可以进一步了解肿瘤的内在耐药机制，并为评估T细胞识别提供重要的模型系统，从而加深我们对MPM中免疫反应的理解。

该方案的主要局限性在于每个肿瘤都含有不同的微环境，并且扩展成功具有高度的可变性。此外，该方法选择可以在2D培养系统中扩展的肿瘤细胞。涉及生产3D球体或类器官培养物的其他方法可以提供一种替代方法，该方法可以实现更高的扩增成功率，或者导致获得无法在传统2D系统中扩增的细胞系的能力。这种3D培养已被证明可用于产生难以扩展的肿瘤类型，例如胰腺癌⁷。

研究方案

这里描述的所有方法都已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心的机构审查委员会（IRB）的批准。这涉及在知情同意后切除的标准护理，手术切除的MPM肿瘤。

1.肿瘤消化培养基等相关培养基的制备

1. 为了制备肿瘤消化培养基，在层流罩中加入5 mL 100%笔/链球菌（青霉素/链霉素）到500 mL无菌罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中。
   1. 将培养基转移到 500 mL、0.22 μm 聚醚砜 （PES） 无菌过滤器中进行真空过滤。
      注意:过滤和抽吸步骤应在标准真空压力为75-150托的范围内进行。
   2. 标记肿瘤消化培养基并注明日期，并将其储存在4°C。
      注意:培养基可在4°C下储存1个月。
2. 为了制备肿瘤消化酶混合物，在层流罩中的50 mL锥形管中加入2.5 mL 3%胶原酶1，1 mL 1.5mg / mL透明质酸酶，20μL 250，000单位/ mL DNAse 1至16.5 mL消化培养基。
   注意:肿瘤消化酶混合物的总体积为20 mL;然而，每个肿瘤样本只需要10 mL。因此，剩余的鸡尾酒可以储存在-20°C，直到需要。不要重新冷冻等分试样。
3. 为了制备完整的肿瘤培养基，在层流罩中加入5 mL 100%笔/链球菌和50 mL胎牛血清（FBS）到500 mL无菌RPMI 1640中。
   1. 将培养基转移到500 mL，0.22μm PES无菌过滤器中进行真空过滤。
   2. 标记并测定整个肿瘤培养基的日期，并将其储存在4°C。
      注意:培养基可在4°C下储存1个月。
4. 为了制备用于饥饿的还原血清培养基，在层流罩中加入5 mL 100%笔/链球菌和5 mLFBS至500 mL无菌RPMI 1640中。
   1. 将培养基转移到500 mL，0.22μm PES无菌过滤器中进行真空过滤。
   2. 标记并减少血清培养基的日期并将其储存在4°C。
      注意:培养基可在4°C下储存1个月。
5. 为了制备冷冻培养基，在层流罩中将5 mL二甲基亚砜（DMSO）加入45 mL FBS中。
   1. 将培养基转移到 50 mL、0.22 μm PES 无菌过滤器中进行真空过滤。
   2. 标记并注明五个 15 mL 锥形管的日期。
   3. 将10 mL冷冻培养基转移到每个管中，并将管储存在-20°C。
6. 为了制备用于支原体检测的无抗生素培养基，在层流罩中加入50 mLFBS至500 mL无菌RPMI 1640。
   1. 将培养基转移到 50 mL、0.22 μm PES 无菌过滤器中进行真空过滤。
   2. 标记无抗生素培养基并注明日期，并将其储存在4°C。
      注意:培养基可在4°C下储存1个月。
7. 为了制备用于表型分析的荧光活化细胞分选（FACS）缓冲液，在层流罩中加入16.6 mL无菌牛血清白蛋白到500 mL无菌1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
   1. 标记FACS缓冲液并注明日期，并将其储存在4°C。
      注意:只要两种组分都无菌储存，FACS缓冲液就不需要过滤器灭菌。FACS缓冲液可在开放前在4°C下储存6个月。

2. 肿瘤组织的消化

1. 将10mL肿瘤消化酶混合物从步骤1.2转移到解离管中。
2. 使用无菌手术刀将肿瘤组织转移到无菌的6孔板盖上。
   注意:与肿瘤组织一起转移的培养基的量足以进行处理。
   1. 使用新的无菌手术刀和镊子去除所有脂肪组织，坏死组织和/或血凝块。
      注意:脂肪组织通常外观淡黄色，呈半固体状。坏死组织在外观上比周围组织更暗，非常柔软;脂肪和坏死组织都很容易破裂。血组织呈鲜红色，在操作时可能会将血液释放到培养基中。一旦切除，产生的肿瘤组织应保持形状，并且根据组织类型为苍白或粉红色。
   2. 将整个肿瘤组织切成1mm³ 个小碎片。为确保组织不会变干，向肿瘤组织中加入500μL无菌1x Hank平衡盐溶液（HBSS）。
3. 将肿瘤碎片转移到含有10mL肿瘤消化酶混合物的解离管中（步骤2.1）。紧紧关闭管子，将其盖面朝下放在组织解离器上，然后通过将其像套管一样施加在解离管上并按压以将其卡入到位来添加加热器装置。
   注意:每个管的最大容量为4g肿瘤和10 mL体积。
4. 选择解离器37C_h_TDK_1上的预编程设置。10分钟后检查状态，以确保没有闪烁的红灯指示的堵塞错误。
   注意:该程序在1，865 rpm下处理1小时，温度为37°C。
   注意:如果发生堵塞，请取下解离管并手动旋转以除去盖子中卡住的任何组织;然后将管子更换到解离器上并恢复程序。
5. 1小时消化后，取出解离管并将其置于层流罩中。通过将70μm细胞过滤器放在50mL锥形管的顶部并使用10mL移液管将消化的肿瘤移液到过滤器上来过滤消化的肿瘤。如果过滤器堵塞，请切换到新的过滤器。
   1. 用10mL新鲜肿瘤消化培养基冲洗解离管，并将洗涤液通过过滤器。
   2. 取下70μm过滤器并将其丢弃。
   3. 用肿瘤消化培养基使总体积达到40 mL。
6. 在室温下以500× g 离心5分钟。
7. 使用连接到真空源的2mL吸液管，在不干扰沉淀的情况下吸出上清液，并使用10mL无菌完全肿瘤培养基重悬细胞。
8. 重复步骤 2.6。
9. 按照步骤2.7中所述吸出上清液。将细胞重悬于3mL无菌完全肿瘤培养基中，并将细胞悬浮液转移到无菌6孔板的一个孔中。
10. 将板保持在37°C和5%CO₂的培养箱中。
11. 24小时后，将所用培养基从孔1中的消化肿瘤转移到同一6孔板中的新孔（孔2）。向孔 1 中加入 3 mL 无菌完全肿瘤培养基。
12. 从孔1和2中转移用过的培养基，并在步骤2.11后24小时在同一6孔板中混合到孔3中。将3 mL无菌完全肿瘤培养基加入孔1和2中。
13. 从所有3个孔中吸出培养基，并在步骤2.12后48小时将3mL完全肿瘤培养基移液到每个孔中。

3. 原发性肿瘤细胞系的生成

1. 使用倒置相显微镜，确定早期传代培养物中成纤维细胞污染的百分比。
   注意:成纤维细胞通常很长且不规则，并且具有不明确的细胞膜。它们在 Z 轴刻度上显得薄或平坦。
   1. 如果成纤维细胞污染大于早期传代培养物中细胞的20%，则在用低量血清培养基替换完整培养基后继续培养。
   2. 在步骤3.1.1中每周重复一次用还原血清培养基替代，持续3-4周。
   3. 当培养物达到80%汇合度时，通过将细胞以50:50分裂成6孔板的2个新孔来传代细胞。一旦细胞达到80%汇合度，在还原血清培养基中继续以50:50传递。
   4. 重复步骤3.1.3长达4周，一旦培养物达到80%汇合度，根据需要在较大的培养瓶中通过50:50分裂来传代。如果成纤维细胞群没有减少到10%或更少，请继续执行步骤3.2以尝试差异胰蛋白酶消化法以去除成纤维细胞污染。否则，请继续执行步骤 3.3。
2. 为了富集肿瘤细胞，用1x PBS轻轻冲洗孔以除去含有血清的培养基。
   1. 按如下方式加入胰蛋白酶:如果在6孔板中，则每孔1 mL，T25烧瓶2mL，T75烧瓶3mL。
   2. 将6孔板或烧瓶置于37°C的培养箱中1分钟。从培养箱中取出板或烧瓶，并使用倒置显微镜检查细胞的粘附性。如果细胞部分抬起或漂浮，轻轻地除去悬浮的细胞和胰蛋白酶。将细胞置于含有等量或更大体积的完整肿瘤培养基的15 mL锥形管中。
      注意:这种基于粘附特性的部分细胞集合是多个级分中的第一个。
   3. 重复步骤 3.2.1 和 3.2.2，直到所有单元格都抬起，或者删除了 4 个分数。
   4. 在室温下以500× g 离心所有独立馏分5分钟。
   5. 按照步骤2.7中所述吸出上清液，并使用5mL无菌的低血清培养基重悬细胞。
   6. 将每个级分的细胞置于T25烧瓶中，并将烧瓶置于37°C的培养箱中。
   7. 在48小时后评估培养物，以确定肿瘤细胞与成纤维细胞的富集部分。丢弃富含成纤维细胞的烧瓶。如果成纤维细胞污染<10%，继续在完全肿瘤培养基中扩增并继续步骤4。如果成纤维细胞污染为10-30%，请重复步骤3.1.2-3.1.4。如果成纤维细胞污染大于30%，重复步骤3.2-3.2.7。
3. 如果在早期传代培养物中检测到很少或没有成纤维细胞，则一旦细胞在其6孔板或烧瓶中80%汇合，通过50:50分裂，继续在完全肿瘤培养基中传递细胞。

4. 早期传代原发性肿瘤细胞系的扩增

1. 一旦原发性肿瘤培养物含有10%或更少的成纤维细胞污染，抽吸培养基并每周两次用无菌完全肿瘤培养基替换它。
   注意:T25的最佳培养基体积为5 mL;T75为12毫升;T150 为 25 毫升。
   1. 一旦培养物在板或烧瓶中达到80%汇合度，就根据需要将培养物以50:50的比例进入较大的烧瓶中。
      注意:根据其生长情况，可能需要以更高的比例传代培养物。调整，使培养物每3-5天达到80%的汇合度。
2. 通过直到文化处于第4通道或以上。一旦培养物在至少两个T75烧瓶中80%汇合，继续执行步骤5。

5. 已建立的原发性肿瘤细胞系的表征和库

1. 冷冻保存一个T75烧瓶作为早期传代冷冻。对于其余T75烧瓶的支原体检测，继续步骤5.2。
   1. 对于早期传代细胞的冷冻保存，解冻步骤1.5中制备的1管等分试样的冷冻培养基。
   2. 通过胰蛋白酶消化收集细胞，首先按照步骤3.2中所述用1x PBS洗涤板，并按照步骤3.2.1所述添加胰蛋白酶。
   3. 将烧瓶置于37°C的培养箱中3分钟。从培养箱中取出烧瓶，并使用倒置显微镜检查细胞的粘附性。如果细胞正在抬起或漂浮，轻轻地去除悬浮的细胞和胰蛋白酶。将细胞置于含有等量或更大体积的完整肿瘤培养基的15 mL锥形管中。
      注意:如果细胞在3分钟后保持贴壁，则将烧瓶放回培养箱中再放置2分钟。
   4. 通过轻轻移液将管充分混合，并取出20μL进行计数。
   5. 在室温下以500× g 离心管5分钟。
   6. 当细胞旋转时，使用实验室特异性计数方案进行计数，例如台盼蓝或吖啶橙/碘化丙啶（AO / PI）。
   7. 离心后的细胞重悬于至少2×10⁶ 个细胞/ 1 mL冷冻培养基的冷冻培养基中。
   8. 将步骤5.1.7中的1mL细胞悬浮液转移到预标记的1.5mL冷冻管中。
   9. 将冷冻管置于受控速率冷冻室中，并立即将其转移到-80°C。
   10. 将细胞在-80°C下储存长达1周，然后将其转移到液氮中长期储存。
2. 将T75烧瓶分开50:50进行支原体检测。将培养基改为步骤1.6中制备的无抗生素培养基。
   1. 72小时后，在测试前在室温下解冻支原体检测试剂，底物和对照品15分钟。
   2. 从要测试的每个培养物中收集1 mL上清液并将其置于15mL锥形管中。
   3. 通过在室温下将上清液以500× g 离心5分钟来沉淀任何悬浮细胞。
   4. 将100μL样品上清液和对照品上质加入白色96孔板中。向每个样品中加入100μL支原体检测试剂并进行对照。
   5. 在室温下孵育5分钟。
   6. 将板放入读板器中并读取发光（读取A，即第一次读取）。
      注意:支原体试剂盒制造商的实验方案表明在多功能读板器上保留默认设置。读取设置在发光端点处，积分时间为1 s，增益为135。读板器使用自动刻度程序来优化每个实验的增益信号。1 s 积分时间是标准默认值。这两种设置都用于调整由读板器解释的发光信号的强度，并且可能需要根据各个读板器进行调整。
   7. 从读板器中取出板，并向每个样品和对照品中加入100μL支原体检测底物。
   8. 在室温下孵育10分钟。
   9. 将印版放入读板器中并读取发光（读数B，即第二次读数）。
   10. 要确定支原体阳性，请确定读数B与读数A的比率。
       注意:支原体阳性率在支原体试剂盒制造商的实验方案中有所描述。读数A和B使用相同的设置获取，并简单地反映读数顺序。
       1. 考虑< 1 的比率为支原体阴性。
       2. 将 1-1.2 的比率视为不确定，并重复步骤 5.2。
       3. 考虑>1.2的比率为支原体阳性并监测该培养;如有必要，终止区域性。
3. 支原体阴性肿瘤细胞的流式细胞术表征
   1. 使用细胞解离缓冲液去除肿瘤细胞。
   2. 从步骤1.7开始，计数细胞并将细胞重悬于FACS缓冲液中的1×10⁶ / mL。
   3. 将100μL细胞悬浮液取出到单个试管中以进行表面染色。
   4. 在室温下以500× g 离心5分钟。
   5. 通过在室温下将细胞在FACS缓冲液中孵育500μL5%山羊血清10分钟来吸出上清液并阻断Fc受体。
   6. 加入2mL FACS缓冲液，并在室温下以500× g 离心悬浮液5分钟。
   7. 吸出上清液并加入抗体（表1）和FACS缓冲液的表面染色混合物，使最终体积为100μL。
   8. 重复步骤 5.3.6。
   9. 吸出上清液并通过在200μL1%多聚甲醛（PFA）加0.25%EtOH中重悬来固定细胞。在室温下孵育20分钟，样品避光。
   10. 重复步骤 5.3.6。将细胞重悬于200μLFACS缓冲液中，以使用适当的流式细胞仪进行采集。
       注意:间皮瘤肿瘤细胞预计间皮素和N-钙粘蛋白呈阳性。有些人也可能表达CD90。
4. 分别如步骤4.1和5.1所述，在完全肿瘤培养基和细胞中展开。

结果

为了确定早期传代培养物的成纤维细胞污染，使用倒置相显微镜评估细胞，以识别成纤维细胞相对于存在的其他贴壁细胞的频率。 图1 显示了与没有成纤维细胞污染的培养物（图1D）相比，成纤维细胞污染增加80%（图1A），50%（图1B）和30%（图1C）的例子。基于这种视觉评估，如上所述?...

讨论

虽然该协议很简单，但必须严格遵守一些关键步骤。如果最初不成功，早期传代冷冻对于保持重复肿瘤细胞富集过程的能力非常重要。通过眼睛评估成纤维细胞污染以确定正确的分裂和培养基匮乏技术的能力对于防止成纤维细胞在培养物中过度生长至关重要。此外，差异胰蛋白酶消化方法需要在孵育过程中仔细观察细胞。细胞可能以不同的速率从塑料板上抬起，这将因细胞系而异。在学习此过程?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML