用于高内涵筛选和分析应用的大规模生产球体的稳健方法

摘要

该协议详细介绍了生产三种不同类型的球体的方法，使其适用于大规模高内涵筛选和分析。此外，还提供了示例，展示了如何在球体和单个细胞水平上分析它们。

摘要

高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）是使研究人员能够从细胞中提取大规模定量表型测量的技术。这种方法已被证明对于加深我们对细胞生物学中广泛的基本和应用事件的理解是强大的。迄今为止，该技术的大多数应用都依赖于使用单层生长的细胞，尽管人们越来越意识到这些模型并不能概括组织中发生的许多相互作用和过程。因此，在开发和使用3维（3D）细胞组件（例如球体和类器官）方面出现了。尽管这些3D模型在癌症生物学和药物递送研究的背景下特别强大，但它们以适用于HCS和HCA的可重复方式进行生产和分析，带来了许多挑战。这里详述的方案描述了一种产生多细胞肿瘤球体（MCTS）的方法，并证明它可以以与HCS和HCA兼容的方式应用于三种不同的细胞系。该方法有助于每孔产生数百个球体，提供了特定的优点，即当用于筛选制度时，可以从每孔数百个结构中获得数据，所有这些都以相同的方式处理。还提供了示例，其中详细介绍了如何处理球体以进行高分辨率荧光成像，以及HCA如何在球体水平以及从每个球体内的单个细胞中提取定量特征。该协议可以很容易地应用于回答细胞生物学中的各种重要问题。

引言

传统上，基于细胞的测定是在固体底物上生长的单层中进行的，这实际上可以被认为是二维（2D）环境。然而，人们越来越认识到，2D细胞培养模型在某些情况下缺乏生理相关性，无法复制细胞之间发生的许多复杂相互作用¹。三维（3D）细胞培养方法在研究人员中迅速流行，3D细胞模型显示出更好地模拟细胞在组织环境中遇到的生理条件的巨大潜力²。已经使用了几种不同类型的3D细胞组件，但最常见的两种类型是球体和类器官。球状体可以从许多不同的细胞系中生长，它们可以根据所使用的细胞类型及其组装方法采用各种形状和大小³。此外，当球状体从癌细胞系生长时，它们也可以被称为多细胞肿瘤球体（MCTS），这些模型已经发现特别适用于临床前 体外 药物递送和毒性研究^4，5。另一方面，类器官旨在更好地模仿我们体内的组织和器官，并且可以采用更复杂的形态安排。类器官的产生涉及使用成体干细胞或多能干细胞，它们可以重新编程到适当的细胞中以类似于感兴趣的组织或器官。它们主要用于研究器官的发育，并对疾病和宿主-病原体相互作用进行建模⁶。

有一系列不同的方法可用于生成 3D 单元组件。基于支架的方法提供了一种底物或支....

研究方案

1. 细胞培养

1. 准备介质
   1. 根据细胞系的类型制备特定的细胞培养基。确保所有用于细胞维护的培养基都含有10%的胎儿牛血清（FBS）。
      注意：不同的细胞系使用不同的培养基。HT-29结肠癌细胞（ATCC HTB-38）在McCoys 5A + 10%FBS中生长。HepG2肝细胞癌细胞（ATCC HB-8065）在最低必需培养基+ 1%L-谷氨酰胺+ 10%FBS中生长。H358支气管肺泡癌细胞（ATCC CRL-5807）在RPMI 1640培养基+ 1%L-谷氨酰胺+ 10%FBS中生长。所有含有 L-谷氨酰胺和 FBS 的介质均称为完整培养基。当电镀细胞作为球体生长时，需要具有10%FBS的无酚红培养基以避免ECM基底材料的着色，这反过来又会在成像过程中引起伪影。
2. 传代培养细胞
   1. 当细胞汇合约80%时，用2mL胰蛋白酶-EDTA（0.25%（w / v）胰蛋白酶/ 0.53mM EDTA）短暂洗涤。吸出胰蛋白酶-EDTA，加入3mL新鲜胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育3-5分钟。
   2. 当细胞从细胞培养皿中分离时，加入7mL新鲜完全培养基。
   3. 将1mL细胞悬浮液移入新的10cm细胞培养皿中，并加入9mL新鲜完整培养基，得到1：10稀释的细胞。
   4. 在37°C下用5%CO ₂的加湿培养箱培养细胞。

结果

在该协议中，详细介绍了一种以球体形式产生3D细胞培养组件的可靠方法，使用不同的细胞类型来表示各种肿瘤组织。该方法允许每孔产生数百个球体，这使得基于细胞的测定能够以高内涵的方式进行（图1）。这种方法以前已被用于研究HT-29球体¹⁶ 中的纳米颗粒摄取和HepG2球体中纳米颗粒诱导的毒性¹⁷。该方法依赖于在光学质量板的孔底部?.......

讨论

这里描述的方法详细介绍了一个平台，该平台以适合HCS和HCA的方式每孔产生数百个球体。与其他流行的方法相比，例如使用平底和圆底ULA板，这些板允许每个孔仅形成一个旋转椭球体^18，19，这种方法为以筛选格式从大量球体中提取高分辨率信息提供了机会。值得注意的是，这种方法已经在3种不同的细胞系中得到证明，代表了各种肿瘤类型，突出了它对.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300054
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A6003
Calcium chloride	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid	Perkin Elmer	6055302	These plates have been renamed as Phenoplates
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated	Gibco	10500064
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
L-Glutamine solution, 200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
Magnesium chloride	Fisher Scientific	10647032
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL	Corning	356237	This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	356231	This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning
McCoy's 5A medium	Gibco	26600023
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red	Hyclone	10358633
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	21090022
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red	Gibco	51200046
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)	Developmental Studies Hybridoma Bank	H4A3-a
Neubauer counting chamber	Hirschmann	8100203
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software	Perkin Elmer	HCSHH14000000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets	Sigma Aldrich	P4417
Polysorbate 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870010
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup sterile vacuum filter units	Millipore	SCGVU05RE