土壤生物多样性中参与顽固性物质降解的真菌的分离与筛选

摘要

在这里，我们提出了一个筛选土壤生物多样性的方案，以寻找参与顽固性物质降解的真菌菌株。首先，分离能够在腐植酸或木质纤维素上生长的真菌菌株。然后在酶测定和碳氢化合物和塑料等污染物上测试它们的活性。

摘要

环境污染是一个日益严重的问题，识别生物修复过程中涉及的真菌是一项基本任务。土壤拥有令人难以置信的微生物生命多样性，可以成为这些生物修复真菌的良好来源。这项工作旨在通过使用不同的筛选测试来寻找具有生物修复潜力的土壤真菌。补充顽固物质作为唯一碳源的矿物培养基作为生长试验。首先，将土壤稀释液镀在培养皿上，用腐植酸或木质纤维素修饰矿物培养基。分离生长的真菌菌落并在不同的基质上进行测试，例如碳氢化合物（凡士林和用过的机油）的复杂混合物和不同塑料聚合物（PET，PP，PS，PUR，PVC）的粉末。定性酶测试与生长测试相关，以研究酯酶，漆酶，过氧化物酶和蛋白酶的产生。这些酶参与顽固物质的主要降解过程，并且它们被检查的真菌菌株的组成性分泌可能被利用用于生物修复。分离和测试了100多种菌株，并发现了几种具有良好生物修复潜力的分离株。总之，所描述的筛选测试是一种从土壤中鉴定具有生物修复潜力的真菌菌株的简单且低成本的方法。此外，还可以根据要求，通过在最少的培养基中添加其他顽固物质来定制不同污染物的筛选测试。

引言

土壤是地球上生命的基本组成部分，也是许多生态系统的基础。土壤中的矿物质，有机物和微生物可以被认为是一个系统，它们之间发生了密切的联系和相互作用。这些化合物的相互作用对陆地过程，环境质量和生态系统健康具有重要影响¹。土壤污染在世界范围内造成了严重的环境问题。不分青红皂白、长期、过量地施用农药、石油产品、塑料等有毒物质，对土壤生态产生严重影响，从而改变土壤微生物群。土壤中的微生物群落由不同生理状态的各种生物组成，其中大多数是细菌和真菌。土壤中的许多污染物具有中长期稳定性，它们的持久性可以导致适应性机制的发展，使微生物能够利用顽固物质作为养分^2，3。因此，这些微生物可以考虑用于生物修复技术。

生物修复试图通过利用微生物及其酶将废物降解或转化为毒性较小或无毒的化合物来减轻污染的影响。各种古菌，细菌，藻类和真菌都具有这种生物修复能力⁴。由于其特殊的生物降解作用，真菌是特别有前途的生物修复生物。它们可以使用其菌丝网络攻击不同的基质，使它们能够比其他微生物更有效地穿透土壤基质。此外，它们可以到达难以接近的间隙，其中污染物难以去除⁵，并且它们还可以承受低湿度水平⁶。此外，真菌合成不同的非....

研究方案

1. 选择能够从土壤中降解顽固物质的真菌菌株

1. 抗生素溶液的制备。
   1. 将青霉素（50毫克/升）、链霉素（40毫克/升）、金霉素（40毫克/升）、新霉素（100毫克/升）和氯霉素（100毫克/升）放入250毫升去离子无菌水中。
   2. 在向抗生素溶液中加入氯霉素之前，将其溶解在3mL≥99%乙醇中。
   3. 将抗生素溶液置于磁力搅拌器（无热量）上，并在溶液内用磁力搅拌棒10分钟。将其储存在4°C。
2. 生长培养基的制备。
   1. 将1克商业腐植酸，3.26克Bushnell-Haas肉汤（BH）和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C下高压灭菌20分钟（腐植酸琼脂）。
   2. 将腐植酸琼脂放入层流柜下的培养皿中。
   3. 将4克木质纤维素，3.26克BH和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C（木质纤维素琼脂）下高压灭菌20分钟。
   4. 将木质纤维素琼脂放入层流柜下的培养皿中。
   5. 在层流柜下，培养基在培养皿中固化后，使用带有0.2μm过滤器的无菌注射器将1mL抗生素溶液转移到制备的板上以对其进行灭菌。
   6. 使用无菌的一次性L形细胞扩张器将抗生素溶液均匀地分布在板表面上，并使其在层流柜下风干。
   7. 将20克麦芽提取物肉汤和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C下高压灭菌20分钟（....

结果

选择性培养基方法（协议第1节）允许筛选土壤丰富的生物多样性，并选择具有高生物修复潜力的真菌。用腐植酸和木质纤维素培养基，分离出100多种真菌菌株。这些真菌产生的酶参与天然顽固材料的生物降解，其化学结构类似于许多污染物。然而，用选择性培养基分离的真菌菌株需要进一步筛选。具体而言，选择性测试分离了能够降解腐植酸和木质纤维素的菌株，生长测试筛选了那些能够使用特.......

讨论

土壤丰富的生物多样性是真菌的丰富来源，具有许多代谢能力，其中一些可能是生物修复的潜在候选者。选择性培养基测试（协议的第1部分）是分离能够在天然复合聚合物上生长的真菌作为其唯一碳源的易于执行和有效的方法。真菌可以产生细胞外、非特异性水解酶和氧化还原酶³⁰ ，例如木质素分解酶laccases和过氧化物酶³¹。这些酶可以降解木质纤维素和腐植?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 microwell plate	Greiner bio-one	650185
Agar	VWR	84609.05
Bushnell-Haas Broth	Fluka	B5051
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Chloroamphenicol	Eurobio	GABCRL006Z
Chlortetracycline	Sigma-Aldrich	Y0001451
CoCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
CuCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3279
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
FeCl3·6H2O	Sigma-Aldrich	236489
Filter 0.2 µm	Whatman	10462200
gallic acid	Sigma-Aldrich	G7384
Glass cover slips	Biosigma	VBS634
Glass vials 15 mL	SciLabware	P35467
guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502
High-density polyethylene (HDPE)	Sigma-Aldrich	434272
Humic acids	Aldrich Chemistry	53680
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Lignocellulose	/	/	Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader	Laboindustria S.p.a	21133
magnetic stirrer	A.C.E.F	8235
Malt Extract Broth	Sigma-Aldrich	70146
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M2643
Micropipette 1000 μL	Gilson	FA10006M
Micropipette 200  μL	Gilson	FA10005M
MnCl2·4H2O	Sigma-Aldrich	M5005
Na2MoO4·2H2O	Sigma-Aldrich	M1651
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neomycin	Sigma-Aldrich	N0401000
Penicillin	Sigma-Aldrich	1504489
peptone	Sigma-Aldrich	83059
Polyethylene terephthalate (PET)	Goodfellow	ES306031
Petri dishes	Laboindustria S.p.a	21050
Petrolatum (Paraffin liquid)	A.C.E.F	009661
Potato Dextrose Broth	Sigma-Aldrich	P6685
Polystyrene (PS)	Sigma-Aldrich	331651
Polyurethane (PUR)	Sigma-Aldrich	GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81388
Sterile falcon tube	Greiner bio-one	227 261
Sterile glass vials 20 mL	Sigma-Aldrich	SU860051
Sterile point 1000  μL	Gilson	F172511
Sterile point 200  μL	Gilson	F172311
Sterile polyethylene bags	WHIRL-PAK	B01018
sterile syringe	Rays	5523CM25
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S-6501
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754
Used engine oil	/	/	complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL	Sigma-Aldrich	33108-U
ZnCl2	Sigma-Aldrich	Z0152