丝状蓝藻腔隙的自然转化、蛋白表达和低温保存

摘要

Phormidium lacuna 是一种从海洋岩石池中分离出来的丝状蓝藻。本文介绍了从天然来源中分离细丝，DNA提取，基因组测序，自然转化，sfGFP表达，冷冻保存和运动性方法。

摘要

蓝藻是基础研究和生物技术项目的重点，其中太阳能用于生物质生产。 Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝藻。本文描述了如何从海洋岩石池中分离出新的丝状蓝藻。它还描述了如何从细丝中提取DNA以及如何对基因组进行测序。虽然许多单细胞物种的转化已经建立，但丝状蓝藻的报道较少。这里描述了一种简化的 P. lacuna 自然转化方法。 P. lacuna 是Oscillatoriales目中唯一建立自然转化的成员。本文还展示了如何使用自然转化来表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源性 cpcB 启动子诱导的表达强度约为 cpc560、 A2813 或 psbA2 启动 子的 5 倍。此外，建立了冷冻保存 P. lacuna 和 Synechocystis sp.CPP 6803的方法，并描述了评估液体介质中以及琼脂和塑料表面上的运动性的方法。

引言

蓝藻是利用光合作用作为能量来源的原核生物^1，2。研究越来越关注蓝藻物种。几种蓝藻可以用DNA³转化。基因可以在这些物种中被敲除或过度表达。然而，转化仅限于少数物种^{4，5，6，7，8，9，10，11}，并且很难在培养品或野生⁸的品系中建立转化。从海洋岩石池中分离出丝状物种 Phormidium lacuna 的菌株（图1），其中环境条件（例如盐浓度或温度）随时间波动。这些丝状蓝藻可以用作它们所属的Oscillatoriales¹² 目模式生物。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 与自然环境隔绝

注意:可以分离绿藻，硅藻，丝状蓝藻和其他微藻。该方案可用于在实验室条件下生长的岩池中的任何微藻物种。属于Oscillatoriales的丝状蓝藻可以通过其运动和丝状形状轻松识别。该物种可以通过基因组测序或16S rRNA测序在半纯状态下鉴定。

1. 将来自海洋岩石池（即岩石海岸的空腔）的液态海水样品转移到50 mL烧瓶中。对于每个烧瓶，请注意自然来源的确切位置或坐标。如果可能，通过50μm的网过滤内容物以减少浮游动物的数量。将样品储存在4°C，直到可以传代培养。
2. 将1 mL培养物转移到含有3%bacto-agar的10cm培养皿中，在f / 2培养基^22，23中（参见材料表）。准备多达 20 个盘子。在50μmol ^{m-2 s-1}的白光下培养。
   注意:更高的光强度可用于培养。强度高达400μmol ^{m-2 s-1} 可用于 P. lacuna，尽管其他物种可能更感光。
3. 一周后，使用无菌镊子将所需细胞转移到新鲜的琼脂平板上。在无菌条件下在双目显微镜下分离细胞。将旧的琼脂平板储存在4°C，直到细胞出现并在新的琼脂平....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

按照上述方法，从岩池中分离出5种不同的 P. lacuna 菌株并测序（图1 和 表1）。除 P. lacuna HE10JO外，所有培养物在传代培养约1年后均无菌。该菌株仍然受到海洋细菌 Marivirga atlantica的污染。在随后的黑尔戈兰岛游览中，从岩石池中分离出其他丝状蓝藻，这些蓝藻与 P. lacuna 不同，需要表征。

对几种DNA提取和纯?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

尽管许多蓝藻菌株可从培养物^{32，33，34，35，36}中获得，但由于这些物种适应特定特性，因此仍需要来自野生的新蓝藻。从岩池中收集 P. lacuna ，并适应盐浓度和温度³⁰的变化。该物种的菌株在2008年，2009年和2010年的短途旅行中被发现。通过这里描述的.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave 3870 ELV	Tuttnauer	3870 ELV
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
BG-11 Freshwater Solution	Sigma Aldrich	C3061
BG-11 medium	Merck	73816-250ML
Boric acid	Merck	10043-35-3	H3BO3
Calcium chloride dihydrate	Carl Roth	10035-04-8	CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL	Greiner	658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL	Greiner	601975
Centrifuge LYNX 4000	Thermo Scientific	75006580	and rotor
Centrifuge microstar 17	VWR International	N/A	for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)	PanReac AppliChem	57-09-0	C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1	PanReac AppliChem	A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Merck	7791-13-1	CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate	Merck	7758-99-8	CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin	Carl Roth	58-85-5	C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb	New England Biolabs	N3232
DNA ladder 100 bp	New England Biolabs	N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S	Brand GmbH	26360	for pipetting 1-25 mL
Ethanol	VWR	64-17-5	C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate	Carl Roth	6381-92-6	EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome	Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2	Zeiss
French Pressure Cell Press	American Instrument Company	N/A
Gel documation System Saffe Image	Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu	ADVANCED
Glassware, different
Glycerol	Carl Roth	56-81-5	C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate	Merck	10025-77-1	FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Kanamycin sulphate	Carl Roth	25389-94-0	C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)	Sigma Aldrich	137-16-6	C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)	Carl Roth	X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight	OSRAM		cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W	Bloom Star	N/A	cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	7791-18-6	MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Serva	13446-34-9	MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750	Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +	Conrad Electronics	2138863-YD	for time-lapse recording
Ocular camera EC3	Leica		for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD	Bresser		for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm	Merck	P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL	Gilson	SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL	Gilson	SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile	Greiner	607107
Plastic tube, sterile, 15 mL	Greiner	188271
Plastic tube, sterile, 50 mL	Greiner	227261
Potassium bromide	Carl Roth	7758-02-3	KBr
Potassium chloride	Carl Roth	7447-40-7	KCl
Power supply Statron 3252-1	Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005	Conrad Electronics		for LED
Proteinase K	Promega	MC500C	from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase	New England Biolabs	M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5	Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002	Illumina
Shaker Unimax 2010	Heidolph Instruments		for cultivation
Sodium acetate	Carl Roth	127-09-3	NaCH3COO
Sodium chloride	Carl Roth	7647-14-5	NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Carl Roth	10049-21-5	NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride	Carl Roth	7681-49-4	NaF
Sodium hydrogen carbonate	Carl Roth	144-55-8	NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate	Serva	10102-40-6	Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate	Merck	7631-99-4	NaNO3
Sodium sulphate	Carl Roth	7757-82-6	Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate	Carl Roth	10025-70-4	SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride	Merck	67-03-8	C12H17ClN4OS · HCl
TRIS	Carl Roth	77-86-1	C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3	Hielscher Ultrasound Technology	UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M	Heidolph Instruments		homogenizer
Urea	Carl Roth	57-13-6	CH4N2O
Vitamin B12	Sigma	68-19-9	C63H88CoN14O14P
Vitamin solution			0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment	VEOLIA water technologies	ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate	Sigma	7446-20-0	ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly	https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline	makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ		software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server	https://rast.nmpdr.org	input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater	0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium	artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+ liquid medium	f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar	3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar	3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution	0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution	0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin