JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

一种简单而全面的方案，用于获取肝脏肝细胞器或其他组织中细胞之间细胞器之间膜接触位点的三维细节。

摘要

长期以来，透射电子显微镜一直被认为是细胞超微结构可视化的黄金标准。然而，分析通常局限于二维，妨碍了全面描述细胞器之间三维（3D）超微结构和功能关系的能力。体积电子显微镜（vEM）描述了一系列技术，这些技术能够以中尺度，微尺度和纳米级分辨率在3D中询问细胞超微结构。

该协议提供了一种可访问且可靠的方法，可以使用串行截面传输EM（TEM）采集vEM数据，并在单个简单的工作流程中涵盖样品处理到数字3D重建的技术方面。为了证明该技术的有用性，提出了内质网和线粒体及其在肝细胞中的接触位点之间的3D超微结构关系。组织间接触在细胞器之间的离子、脂质、营养物质和其他小分子的转移中起着至关重要的作用。然而，尽管它们在肝细胞中最初被发现，但关于它们的物理特征，动力学和功能仍然有很多需要了解的地方。

舌间接触可以显示一系列形态，在两个细胞器彼此之间的接近程度（通常约为10-30nm）和接触部位的范围（从点状接触到较大的3D蓄水池样接触）方面有所不同。密切接触者的检查需要高分辨率成像，连续切片TEM非常适合可视化肝细胞分化过程中组织间接触的3D超微结构，以及与代谢疾病相关的肝细胞结构的改变。

引言

自20世纪30年代发明以来，电子显微镜使研究人员能够可视化细胞和组织的结构成分1，2。大多数调查都提供了2D信息，因为构建3D模型需要费力的串行截面收集，手动摄影，负片处理，手动描摹以及从玻璃，塑料或聚苯乙烯泡沫塑料3，4板中创建和组装3D模型。近70年后，该过程的许多方面都取得了相当大的进步，从显微镜性能，串行切片收集，自动数字成像，用于3D重建，可视化和分析的复杂软件和硬件到现在统称为体积EM（vEM）的替代方法。这些vEM技术通常被认为在微米尺度上以纳米分辨率提供3D超微结构信息，并包括透射电子显微镜（TEM）和较新的扫描电子显微镜（SEM）技术;请参阅评论5，6，7，8。

例如，聚焦离子束SEM（FIB-SEM）使用SEM内部的聚焦离子束在对块表面进行顺序SEM成像扫描之间铣削掉块的表面，从而允许对样品进行重复的自动铣削/成像，并建立用于重建的3D数据集9，10。相反，串行块面SEM（SBF-SEM）在成像11，12之前使用SEM内部的超薄切片机从块面上除去材料，而阵列断层扫描是一种非破坏性过程，需要收集串行部分，在盖玻片，晶圆或胶带上，然后设置自动成像SEM中连续部分的感兴趣区域以生成3D数据集13.与阵列断层扫描类似，串行截面TEM（ssTEM）要求在成像之前收集物理截面;但是，这些部分被收集在TEM网格上，并在TEM14，15，16中成像。ssTEM可以通过执行倾斜断层扫描17，18，19来扩展。连续倾斜断层扫描在 x， y 和z中提供最佳分辨率 ， 虽然它已被用于重建整个细胞20，但它具有合理的挑战性。该协议侧重于ssTEM的实际方面，作为许多EM实验室最容易获得的vEM技术，这些实验室目前可能无法访问专门的切片或vEM仪器，但可以从生成3D vEM数据中受益。

用于3D重建的连续超显微切除术以前被认为是具有挑战性的。很难切割均匀截面厚度的直带，能够以正确的顺序排列和拾取正确尺寸的丝带，并将它们放在具有足够支撑的网格上，但是没有网格条遮挡感兴趣的区域，最重要的是，在不丢失截面的情况下，因为不完整的系列可能会阻止完整的3D重建21。然而，对商用超微球切割机、金刚石切割和修整刀22，23、网格21，24上的电子光亮支撑膜以及用于辅助截面附着力和色带保存的粘合剂13，21 的改进只是多年来使该技术在许多实验室中更加常规的一些渐进式进步。一旦收集了连续切片，TEM中的串行成像就很简单，并且可以提供具有 x 和y的亚纳米px大小的EM图像 ， 从而允许对亚细胞结构进行高分辨率询问 - 这是许多研究问题的潜在要求。这里介绍的案例研究展示了ssTEM和3D重建在肝细胞内质网（ER）-细胞器接触研究中的使用，其中ER-细胞器接触首次观察到25，26。

在与核包膜连续的同时，ER还与许多其他细胞器密切接触，包括溶酶体，线粒体，脂质液滴和质膜27。ER-细胞器接触与脂质代谢28，磷酸肌醇和钙信号传导29，自噬调节和应激反应30，31有关。ER-细胞器接触和其他器官间接触是高度动态的结构，对细胞代谢需求和细胞外线索作出反应。它们已被证明在形态学上在其大小和形状以及细胞器膜32，33之间的距离上有所不同。据认为，这些超微结构差异可能反映了它们不同的蛋白质/脂质组成和功能34，35。然而，定义组织间接触并对其进行分析仍然是一项具有挑战性的任务36.因此，需要一种可靠而简单的方案来检查和表征组织间接触，以便进一步检查。

由于ER-细胞器接触的范围在膜到膜分离中的范围为10至30nm，因此鉴定的金标准历来是TEM。薄切片TEM已经揭示了驻留ER蛋白在不同膜接触处的特定亚域定位37。传统上，这揭示了具有nm分辨率的ER细胞器接触，但通常仅呈现这些相互作用的2D视图。然而，vEM方法以3D形式揭示了这些接触部位的超微结构呈现和背景，能够完全重建接触点并更准确地对接触物进行分类（点状vs管状vs.蓄水管样）和定量38，39。除了作为第一个观察到ER-细胞器接触的细胞类型25，26之外，肝细胞还具有广泛的其他器官间接触系统，这些系统在其结构和生理学中起着至关重要的作用28，40。然而，肝细胞中 ER 细胞器和其他器官间接触的彻底形态学表征仍然缺乏。因此，在再生和修复过程中，组织间接触如何形成和重塑与肝细胞生物学和肝功能特别相关。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

所有动物都按照英国内政部的指导方针进行饲养，组织收获是根据1986年英国动物（科学程序）法案进行的。

1. 标本固定和制备

  1. 将肝组织解剖成适当大小的碎片，约8 mm x 8 mm x 3 mm，并将切片置于温磷酸盐缓冲盐水（PBS，37°C）中。
  2. 将室温（20-25°C）固定剂（1%蔗糖中的1.5%戊二醛，0.1M二甲酸钠）注射到肝脏碎片中，并在室温下将其从PBS转移到固定剂中长达20分钟。始终将组织浸没在溶液中以避免干燥。
    注意:醛类是具有腐蚀性和潜在致癌性的刺激物。二甲苯酸钠如果吞咽或吸入是有毒的。所有固定剂必须在穿着适当的个人防护装备的情况下进行，实验应在通风橱中进行。良好的固定会导致组织更紧致。
  3. 用刀片，冰浴和充满PBS的冷缓冲托盘设置振动切片机。用氰基丙烯酸酯胶将第一块固定的肝脏组织安装在标本架上，并将块转移到振动切片机上。
  4. 按照制造商的建议，接近组织并将固定的肝脏切片成100μm厚的切片。
  5. 使用刮刀或天然发笔收集切片，并将其转移到含有冰冷固定物（1.5%戊二醛，0.1M二甲苯酸钠）的12孔或24孔培养皿中。将切片放在冰上，直到所有样品都已切片并准备进一步处理。
  6. 选择含有感兴趣区域的切片进行进一步处理，并用温和的搅拌洗涤。在12孔或24孔培养皿中用室温0.1M二甲苯酸钠进行三次5分钟的洗涤，确保切片有足够的缓冲液自由移动。
    注意:一般来说，感兴趣的区域是根据与研究的生物学问题相关的解剖学特征来选择的，并由可能存在于整个系列中的组织区域指导，例如，不在部分的边缘，并且保存完好。
  7. 在通风橱中，用新鲜制备的1%四氧化锇/ 1.5%铁氰化钾代替0.1 M二甲苯酸钠。将12孔或24孔培养皿放入密封容器中，并将容器转移到危险化学品冰箱中1小时。
    注意:锇在摄入、吸入和皮肤接触的情况下非常危险。铁氰化钾是一种刺激物，通过吸入和皮肤接触有害。始终使用适当的个人防护装备进行处理，并在通风橱中进行实验。
  8. 在通风橱中，将四氧化锇/铁氰化钾取出到专用的锇废液瓶中，并用0.1M二甲苯酸钠洗涤样品5分钟三次。将样品放在4°C的密封容器中过夜。
    注意:潜在的暂停点。样品可以在4°C的密封容器中储存在0.1M二甲苯酸钠中数周，对保存几乎没有损害。确保有足够的缓冲液来防止干燥。
  9. 将样品与新鲜制备的1%单宁酸在0.05M二甲苯酸钠中在室温下黑暗中孵育45分钟。
    注意:单宁酸是一种刺激物，可对眼睛造成伤害。穿戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行实验。
  10. 在脱水和包埋之前用ddH2O进行三次5分钟的洗涤。

2. 样品脱水、Epon 树脂包埋和安装

  1. 按照以下重量比制备Epon树脂（见步骤2.2）。用装有搅拌棒的 100 mL 一次性塑料烧杯对天平进行去皮。从5个一次性塑料巴斯德移液器上切割末端，并用它们将粘性树脂成分转移到烧杯中。
  2. 依次向烧杯中加入19.2克树脂-812、7.6克DDSA、13.2克MNA和0.8克DMP-30促进剂。使用第五个干净的塑料巴斯德移液器，用手彻底混合树脂组分。
    注意:避免引入气泡，但要确保底部树脂与顶部充分混合，以实现组分层的颜色变化和粗混。所有树脂成分都是刺激物，通过吸入和皮肤接触有害。DMP-30具有腐蚀性，可引起皮肤腐蚀。穿戴适当的个人防护装备。
  3. 将烧杯放在磁力搅拌器上，轻轻搅拌，定期手动混合树脂。
  4. 用70%乙醇轻轻搅拌洗涤样品5分钟;重复一次。
  5. 用90%乙醇轻轻搅拌洗涤样品5分钟;重复一次。
  6. 用100%乙醇轻轻搅拌洗涤样品5分钟;重复一次。
  7. 当样品在通风橱中100%乙醇洗涤时，在带有耐环氧丙烷（PO）的塑料盖的玻璃瓶中制备50:50（v / v）环氧丙烷（PO）:Epon混合物。小心但牢固地夹在玻璃小瓶盖上，同时保持盖子和小瓶的握持，摇晃或涡旋混合。
    注意:环氧丙烷是一种剧毒易燃的刺激物，可溶解某些塑料。穿戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行实验。
  8. 步骤2.6后，将样品与PO:Epon一起在抗PO容器（例如， 铝托盘或玻璃小瓶）中孵育1小时，并在通风橱中轻轻摇动/搅拌。
  9. 在通风橱中，将样品转移到100%Epon。在室温下在通风橱中摇动/旋转/搅拌孵育2小时。将PO:Epon混合物转移到专用的玻璃Epon废液瓶中。
  10. 重复步骤 2.9 一次。
  11. 装载用于嵌入的示例。根据切片的大小和感兴趣的区域，直接将切片安装到预聚树脂残渣上，或将其平埋以进行解剖，并在以后重新嵌入。
    注意:对于平嵌入，可以使用"投射幻灯片"一次嵌入多个切片。剩余的树脂可用于填充光束胶囊并烘烤以制成预聚的残渣或冷冻以备后用。
  12. 一旦安装并覆盖足够的树脂以填充"铸造载玻片"腔，在60°C的烤箱中烘烤样品过夜。
    注意:潜在的暂停点。样品可以在室温下储存多年。
  13. 对于重新包埋，确定平面包埋组织切片中感兴趣的区域。使用珠宝商的锯子，切出适当大小的组织片（1 mm2 至4 mm2），并使用步骤2.2中制备的树脂重新嵌入到预聚合块的顶部，并在60°C烤箱中烘烤过夜。
    注:或者，可以使用双组分环氧树脂将组织片粘在短截线或销钉上。静置过夜。潜在的暂停点。

3. 嵌入样品的修剪和连续切片

注意:切片是一门习得的技能;在尝试连续切片之前，用户应精通超薄切片。由于确切的切片机控制因制造商而异，因此请遵循制造商的说明和指南。

  1. 将样品锁定在修剪适配器中后，使用剃须刀片仔细修剪树脂嵌入的组织，以满足以下标准（参见 图1A，B）:
    1. 确保有一个平坦的顶部表面，露出感兴趣区域周围的组织。
    2. 确保梯形形状，顶部和底部边缘干净且平行。
    3. 确保 x 中 200-500 μm，y 中 100-500 μm 。
    4. 确保块面不对称，例如， 右侧角约为90°，左上角钝，左下角锐。
      注意:修剪冷冻刀可以作为剃须刀片的替代工具。其他建议是为了方便用户在成像时订购部分。可选:如果截面无法形成稳定的碳带，则可以在砌块面的前缘施加接触水泥以帮助形成碳带。剃须刀片锋利;注意握住剃须刀刀片，以免意外滑落造成人身伤害。

figure-protocol-3174
图1:连续截面TEM工作流程。 （A）树脂块中试样图。（B）修剪块以生成梯形形状，其边缘适合于连续切片和不对称块面以确保已知方向。（C）图显示了在金刚石刀船上漂浮在水面上的连续部分的丝带。（D） 在直径为 3 mm 的 TEM 槽网格上显示截面和色带组织的示意图，指示截面的顺序。（E） 透射电镜成像和导航。显示色带和截面顺序，并在显示器上使用"黄色星形贴纸"进行屏幕参考，以确保在后续节中重新成像相同的感兴趣区域。（F） 图像对齐和裁剪。（G） 分割、3D 重建和可视化。缩写:TEM=透射电子显微镜。 请点击此处查看此图的大图。

  1. 修剪后，将试样电弧与卡盘和样品一起转移到切片机的试样臂上，定位试样弧，使电弧的行程范围从上到下运行;将试样电弧固定到位。
  2. 将金刚石刀放入刀架中并锁定，确保将切割角度适当地设置在刀上。将刀架牢固地锁定在载物台上。
  3. 随着舞台的升光，使用刀前进，同时不断检查块面和刀刃之间的关系。小心地将刀朝向试样，通过调整相关旋钮不断调整刀的横向角度、试样倾斜度和试样旋转，直到块与刀刃对齐。
  4. 关闭舞台升光;打开舞台筒灯;设置试样臂切割窗口的顶部和底部;并将试样留在刀刃下方。
  5. 用干净的ddH2O填充刀船，并确保水面与刀刃水平并且略微凹陷。
  6. 可选:将睫毛浸入0.1%的Triton X-100中，然后在刀舟水中降低水的表面张力，以帮助氯仿和色带拾取。
  7. 准备工作站，包括睫毛（睫毛粘在鸡尾酒棒上），formvar涂层的槽网格，标记的交叉镊子，氯仿，0.1%Triton X-100溶液，蒸馏水，滤纸和带网格盒笔记的网格盒。
  8. 将切割速度设置为 1 mm/s，将初始切割厚度设置为 100 nm，然后开始切割循环。
  9. 切割第一个截面后，将切割参数更改为0.8 mm /s的切割速度，将切割厚度更改为70 nm，然后继续切割，允许部分形成沿充满水的刀舟表面向下移动的带状（图1C）。
    注意:重要的是要了解所生产的截面的颜色，因为这通常是树脂截面厚度的更准确的指南。银段通常厚约70nm，而灰色截面较薄，金段较厚。
  10. 让切片机继续切割切片，让色带变长。
    注意:避免房间内出现大振动和物理干扰非常重要。气流会导致刀舟中的部分在水面上移动，物理振动会导致切片机切割不均匀。
  11. 一旦收集了足够的部分，并且在碳带到达船的末端之前，停止切割（就在样品通过刀刃之后）。
    注意:所需的截面数量取决于块面的大小和要收集的数据集的大小。因此，当切割部分脱落时，了解块的大小和槽网格之间的关系是很有用的。
  12. 每只手都用睫毛，轻轻地将缎带分成较小的缎带，可以适合槽网格的长度，注意从样品中记下它们的相对位置。
    注意:如果它们的组合宽度适合，则可以将多个色带轻轻地彼此相邻放置，并在单个插槽网格中一起拾取。如果在单个插槽网格上拾取多个色带，请注意色带的顺序和相对位置。例如， 始终将色带进一步放置在样品中已有的色带右侧的样品中（图1D）。
  13. 可选:使用玻璃涂抹杆，将一滴氯仿悬停在切片上以使其变平。
    注意:氯仿是有毒的和刺激物。不要让氯仿接触水面或水面。如果不小心，需要将水取出并清洗刀，然后再返回切片。氯仿会损坏切片，并降解将钻石固定到刀舟中的胶水。
  14. 使用第一个编号的镊子，拿起第一个空槽网格（在槽的右侧，formvar侧向下），轻轻浸入Triton X-100，然后在蒸馏水中浸泡两次，然后使用一张滤纸从镊子边缘除去多余的水。
  15. 一只手拿着睫毛，另一只手拿着镊子，将大约2/3的 formvar涂层槽网格轻轻地降低到刀舟的水中（远离各部分），使formvar一侧朝下，并且槽的右手长边缘在水面上并且与水边平行。
  16. 轻轻地将水中的网格向色带飘动，以便在返回行程时，各部分向网格漂移。继续在越来越小的波浪中执行此操作，直到色带的右边缘与插槽的右边缘对齐。然后，在最后一个波浪中，轻轻地将网格向上拾取部分到插槽网格中。
  17. 将网格放在镊子中干燥，然后将其存放在网格框中，并在网格框参考表上适当注释。
  18. 重复步骤 3.16，直到收集完所有功能区，确保保持功能区的顺序。
  19. 如果需要进一步的截面，请将刀缩回150纳米左右，检查船上的水位，并根据需要添加更多。按照步骤3.11-3.18再次开始切割过程。
  20. 收集完所有部分后，确保刀刃没有部分碎屑，将刀从块面上收回，然后取出并清洁刀。

4. 网格染色

  1. 干燥后，用雷诺兹柠檬酸铅在工作台上的副膜上或培养皿中染色切片。将几粒氢氧化钠颗粒放在培养皿盖下，以提供无二氧化碳的环境。然后，小心地远离沉淀，移液40μL滴的雷诺兹柠檬酸铅在对映膜上，每个网格一个。
    注意:不要一次染色太多的网格;例如，最大值应为 6。尽量不要直接在染色盘上呼吸。二氧化碳可以与柠檬酸铅反应，并在电网上引起不必要的沉淀。
  2. 将每个网格（部分朝下）倒置到柠檬酸铅滴上，并在培养皿盖下放置7至10分钟。当网格染色时，在每个网格上用五滴300μL蒸馏水在工作台上准备更大的第二块parafilm。
  3. 在柠檬酸铅孵育结束时，将每个网格转移到蒸馏水滴中洗涤1分钟，而无需直接在网格上呼吸。
  4. 重复步骤 4.3 总共五次。
  5. 使用编号的交叉镊子，拿起第一个网格，触摸网格的边缘以过滤纸以吸走大部分水，并在镊子中干燥（至少20分钟）。对每个网格重复上述步骤。

5. 透射电镜成像采集

注意:由于确切的TEM控制因制造商而异，因此请遵循制造商的说明和指南。以下步骤应由已经精通TEM使用的用户执行。

  1. 在成像之前，执行通常的检查，例如光束对准、增益参考和样品偏心度。
  2. 小心地将连续切片的第一个网格加载到标本架中，注意将槽（以及切片）与显微镜载物台的垂直轴对齐。
    注意:这种精度不是必需的，但可以节省采集和未来数据处理阶段的时间。插入网格（截面朝下或截面朝上）时，请注意以相同的方向对所有格网进行成像。
  3. 在低放大倍率下，观察串行部分的顺序，位置和位置（图1E）。导航到网格上系列的中间部分。
    注意:根据确切的研究目的，成像方法可能会有所不同;但是，以下是一个有用的起点。截面的形状和功能区的关系（如步骤 3.14 中所示）决定了哪个截面排在网格上，哪个截面排在最后。
  4. 浏览样本并确定感兴趣的区域。以所需的放大倍率观察样品，并考虑以略低的放大倍率收集序列，因为部分通常不完全对齐，并且以后可能需要裁剪图像。
  5. 以较低的放大倍率拍摄参考图像，以欣赏感兴趣区域的背景，其相对于截面边界的不同放大倍率下的粗略位置以及样品中的地标特征。使用它们在其他部分中签署感兴趣的区域。
  6. 可选:对于屏幕参考，使用可重复使用的粘性腻子，贴纸或一张贴在屏幕上的高架投影仪（OHP）纸，在屏幕上放置临时标记，以允许在整个数据集中对图像中心感兴趣区域的相同特征进行例行重新成像（参见 图1E中的黄色星号）。
  7. 使用参考图像，导航到网格第一部分的感兴趣区域，并以所需的放大倍率获取图像。
    注意:保存图像时，请记下系列的第一个图像的第一个文件名，并使用顺序命名法，以便所有图像名称都遵循序列部分的顺序。
  8. 导航到下一部分并重复步骤 5.7，直到针对该感兴趣区域的所有部分都已成像完毕。

6. 图像导出和串行截面对齐配准

  1. 将属于同一堆栈的图像文件导出到单个文件夹中。确保文件夹按文件名排序。
    注意:理想情况下，图像应具有相同的根名称，并遵循其获取顺序。
  2. 打开斐济，然后单击 文件|导入|图像序列。
  3. 单击文件夹的第一个图像，然后单击" 打开"。等待序列 选项 的弹出窗口出现（图2A）。

figure-protocol-7461
图 2:使用 Fiji 创建串行堆栈和串行部分对齐。 （A） 屏幕截图显示了加载用于创建串行堆栈的图像时的序列选项。（B） TrackEM2 插件的屏幕截图和插件的关键窗口。在切片分离中按 OK 继续对齐。（C） 将串行堆栈成功加载到可视化窗格后的屏幕截图。选择对齐 堆栈切片 后，将弹出三个连续的对齐参数窗口。对齐完成后导出对齐的堆栈。 请点击此处查看此图的大图。

  1. 点击 以数字方式对名称进行排序|转换为 8 位 选项。按 确定。
    注意:转换为 8 位有助于将数据导入 Amira 并减小文件大小，从而在后续步骤中实现更快的处理速度。
  2. 检查所创建堆栈的完整性、顺序和放大倍数。将创建的堆栈另存为.tif文件。
    注:图像应以相同的放大倍率获取。
  3. 执行 TrakEM2 插件41。转到 文件|新|TrackEM2 （空白）。
    注意:该插件将要求用户保存TrackEM2文件。如果需要，请将 TrackEM2 文件保存到图像文件夹中。应显示三个窗口:一个项目窗口、一个堆栈导航（左）窗口和一个堆栈可视化窗格（图 2B）。
  4. 右键单击到黑色可视化窗格。单击 "导入|"导入堆栈 并选择之前创建的堆栈。
  5. 单击 确定 将堆栈加载到堆栈导航窗口。
    注意:将弹出切片分离窗口以询问像素和维度关系。对于仅堆栈对齐，请单击" 确定 "以跳过此步骤。
  6. 使用滑块检查堆栈的所有切片。查找加载的切片，该切片将在导航计划中显示为修补程序。选择将包含在以下对齐方式中的修补程序。
    注意:选定的修补程序将变为蓝色。
  7. 将鼠标悬停在查看窗格上。右键单击图像，选择"对齐|对齐堆叠切片（图2C-1）。
  8. 通过一组三个连续窗口指定对齐参数。
    注意:对于大多数数据，从刚性对齐开始（允许旋转和平移，但不允许变换），并将其他参数保留为默认值（图 2C-2）。
  9. 允许对齐运行，直到读出日志显示 蒙太奇完成。
    注意:运行时取决于体素的数量和计算机的速度。
  10. 检查查看窗格中对齐的堆栈。按 Alt 和 - 键（在 PC 中）或 Ctrl 和 - 键（在 Mac 中）以缩小对齐堆栈的视图。
  11. 如果对对齐的堆栈感到满意，请右键单击 "导出|制作平面图像 以保存对齐的堆栈。
  12. 选择第一个图像作为堆栈的起点，最后一个图像作为堆栈的末尾，单击 OK（图 2C-3）。将对齐的堆栈另存为.tif。
    注意:要减小文件大小，请裁剪数据以仅包含必要的感兴趣区域。
  13. 如果需要，在对齐的堆栈上执行仿射对齐。打开斐济的对齐堆栈，选择 插件|报名|StackReg.
  14. 选择 仿射 选项，然后按 确定。等到程序完成。
  15. 使用不同的文件名保存仿射对齐的堆栈。

7. 分割和3D重建

  1. 打开阿米拉42。单击 "文件|打开"数据" 以加载对齐的堆栈。
  2. 在新的弹出窗口中指定体素测量值（图3A）。

figure-protocol-9813
图 3:使用 Amira 对串行堆栈进行分段。（A） 加载对齐堆栈之前的体素定义弹出窗口。（B） 堆栈导入后项目界面的屏幕截图。选择"分割"选项卡以在"分割编辑器"面板中启动对象跟踪。（C） 分段选项卡的主要功能。在"分割"选项卡的"分割编辑器"部分中定义要分割的对象。使用缩放功能帮助识别物体。选择"画笔"工具并追踪对象的边界。单击"选择"下的 + 符号以分配跟踪。指定的对象在正射切片查看窗格中将显示为具有红色边界。请点击此处查看此图的大图。

注意:图像堆栈节点将出现在项目界面中，正交切片将显示在右侧的查看窗格中（图 3B）。

  1. 要开始分段，请选择 "分段"选项卡 （图3B）。
    注意:建议在分段之前和期间保存分段进度。转到 模型|将模型另存为 适合的任何 .am 文件。
  2. 单击分割编辑器面板中的新建以定义材料列表中的新对象。单击鼠标右键可更改对象的颜色，双击可重命名对象。
  3. 对于手动分割，请选择材料列表下方的 分割 工具。选择默认的 画笔 工具以突出显示像素（图3C）。
    注: 或者，使用 画笔 工具描摹对象的轮廓，然后按 Shift + F 填充对象。
  4. 要将 画笔 工具转换为 橡皮擦，请在选择要校正的像素时按住 Ctrl 键。为堆栈中的每个切片添加批注。
  5. 确认后，通过单击 + 号将所选内容分配给标签。单击 - 符号以删除所选内容。
  6. 分段完成后，返回到项目界面。查找具有连接到图像堆栈的".label"扩展名的节点。
  7. 右键单击".label"扩展名，然后选择" 生成曲面|应用 以创建 .surf 文件。
  8. 要渲染分割对象的 3D 模型，请右键单击 .surf 文件，然后选择" 曲面视图 "以在查看窗格中生成 3D 模型。
  9. 保存 3D 模型以进行可视化或进一步的定量分析。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

对于这种技术，根据生物学研究目的选择感兴趣的区域，并在修剪和分割嵌入的组织之前确定。同样，块面的大小可能由研究问题决定;在这种情况下，对样品进行修剪以留下约0.3 mm x 0.15 mm的块面（图4A）。这允许每个网格有两个9个序列部分的网格，提供18个串行部分，并包含体积约为62μm3 （316μm x 150μm x 1.3μm）的肝组织体积。该体积足以允许肝脏组织中单个线粒体...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

该协议描述了一种可访问的vEM技术，用于可视化3D中的细胞器结构和相互作用。肝细胞中组织间接触的形态学作为案例研究在这里提出。然而，这种方法也被应用于研究各种其他样品和研究领域，包括周围神经45中的Schwann细胞 - 内皮相互作用，内皮细胞46中的Weibel Palade体生物发生，肾细胞47中的货物分泌以及海马神经元中的突触形态

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Joanna Hanley，Rebecca Fiadeiro和Ania Straatman-Iwanowska的专家技术援助。我们还感谢Stefan实验室成员和Ian J. White的有益讨论。J.J.B由伦敦大学学院MRC分子细胞生物学实验室的MRC资助，奖励代码MC_U12266B。C.J.S.由MRC资助，资助伦敦大学学院分子细胞生物学大学MRC实验室，奖励代码MC_UU_00012/6。P.G.由欧洲研究理事会资助，拨款代码ERC-2013-StG-337057。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm syringe filterSarstedt83.1826.001
Aluminum traysAgar ScientificAGG3912
Amira v6ThermoFisherhttps://www.thermofisher.com
ChloroformFisherC/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic AnhydrideTAABT027Epon ingredient
Diamond knifeDiaTOMEultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenolTAABD032Epon ingredient
Dumont Tweezers N5Agar ScientificAGT5293
Fijihttps://imagej.net/
Fiji TrakEM2 pluginhttps://imagej.net/
Formaldehyde 36% solutionTAABF003
Formvar coated slot gridHomemadeAlternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rodMedisca6258
Glass vialsFisher Scientific15364769
Gluteraldehyde 25% solutionTAABG011
MNA/Methyl Nadic AnhydrideTAABM011Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solutionTAABO005
Potassium FerricyanideSigma-AldrichP-8131
Propylene oxideFisher ScientificE/0050/PB08
Reuseable adhesiveBlue Tack
Reynolds Lead CitrateTAABL037Section stain
Sodium CacodylateSigma-AldrichC-0250to make 0.1 M Caco buffer
Super GlueRS Components918-6872Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 ResinTAABT023Epon ingredient
Tannic acidTAABT046
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Two part Epoxy ResinRS Components132-605Alternative: Step 2.13
UltramicrotomeLeicaUC7
Vibrating microtomeLeica100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cementDAP107Contact adhesive: Step 3.1.4

参考文献

  1. Knoll, M., Ruska, E. Das elektronenmikroskop. Zeitschrift für Physik. 78 (5), 318-339 (1932).
  2. von Ardenne, M. Daselektronen-rastermikroskop. Zeitschrift für Physik. 109 (9), 553-572 (1938).
  3. Bang, B. H., Bang, F. B. Graphic reconstruction of the third dimension from serial electron microphotographs. Journal of Ultrastructure Research. 1 (2), 138-139 (1957).
  4. Birch-Andersen, A. Reconstruction of the nuclear sites of Salmonella typhimurium from electron micrographs of serial sections. Journal of General Microbiology. 13 (2), 327-329 (1955).
  5. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  6. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  7. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  8. Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
  9. Heymann, J. A., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  10. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  11. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  12. Martone, M. E., Deerinck, T. J., Yamada, N., Bushong, E., Ellisman, M. H. Correlated 3D light and electron microscopy: use of high voltage electron microscopy and electron tomography for imaging large biological structures. Journal of Histotechnology. 23 (3), 261-270 (2000).
  13. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  14. Sjostrand, F. S. Ultrastructure of retinal rod synapses of the guinea pig eye as revealed by three-dimensional reconstructions from serial sections. Journal of Ultrastructure Research. 2 (1), 122-170 (1958).
  15. Ware, R. W. Three-dimensional reconstruction from serial sections. International Review of Cytology. 40, 325(1975).
  16. Stevens, J. K., Davis, T. L., Friedman, N., Sterling, P. A systematic approach to reconstructing microcircuitry by electron microscopy of serial sections. Cognitive Brain Research. 2 (3), 265-293 (1980).
  17. Hoppe, W. Three-dimensional electron microscopy. Annual Review of Biophysics. 10, 563-592 (1981).
  18. Frank, J. Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. , Springer. New York, NY. (2008).
  19. Baumeister, W. Electron tomography: towards visualizing the molecular organization of the cytoplasm. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 679-684 (2002).
  20. Hoog, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  21. Harris, K. M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M., Ostroff, L., Hurlburt, J. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  22. Jesior, J. C. Use of low-angle diamond knives leads to improved ultrastructural preservation of ultrathin sections. Scanning Microscopy Supplement. 3, 147-152 (1989).
  23. Studer, D., Gnaegi, H. Minimal compression of ultrathin sections with use of an oscillating diamond knife. Journal of Microscopy. 197, 94-100 (2000).
  24. Gay, H., Anderson, T. F. Serial sections for electron microscopy. Science. 120 (3130), 1071-1073 (1954).
  25. Bernhard, W., Rouiller, C. Close topographical relationship between mitochondria and ergastoplasm of liver cells in a definite phase of cellular activity. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2, 73-78 (1956).
  26. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1 (4), 188-211 (1953).
  27. Wu, H., Carvalho, P., Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science. 361 (6401), (2018).
  28. Vance, J. E. Inter-organelle membrane contact sites: implications for lipid metabolism. Biology Direct. 15 (1), 24(2020).
  29. Stefan, C. J. Endoplasmic reticulum-plasma membrane contacts: Principals of phosphoinositide and calcium signaling. Current Opinion in Cell Biology. 63, 125-134 (2020).
  30. Zaman, M. F., Nenadic, A., Radojicic, A., Rosado, A., Beh, C. T. Sticking with it: ER-PM membrane contact sites as a coordinating nexus for regulating lipids and proteins at the cell cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 675(2020).
  31. van Vliet, A. R., Sassano, M. L., Agostinis, P. The unfolded protein response and membrane contact sites: tethering as a matter of life and death. Contact. 1, 1-15 (2018).
  32. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Interacting organelles. Current Opinion in Cell Biology. 53, 84-91 (2018).
  33. Hariri, H., et al. Lipid droplet biogenesis is spatially coordinated at ER-vacuole contacts under nutritional stress. EMBO Reports. 19 (1), 57-72 (2018).
  34. Stefan, C. J., Trimble, W. S., Grinstein, S., Drin, G. Membrane dynamics and organelle biogenesis-lipid pipelines and vesicular carriers. BMC Biology. 15 (1), 102(2017).
  35. Eisenberg-Bord, M., Shai, N., Schuldiner, M., Bohnert, M. A tether is a tether is a tether: tethering at membrane contact sites. Developmental Cell. 39 (4), 395-409 (2016).
  36. Scorrano, L., De Matteis, M. A., Emr, S., Giordano, F. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10 (1), 1287(2019).
  37. Lak, B., Li, S., Belevich, I., Sree, S. Specific subdomain localization of ER resident proteins and membrane contact sites resolved by electron microscopy. European Journal of Cell Biology. 100 (7), 151180(2021).
  38. Collado, J., Kalemanov, M., Campelo, F., Bourgoint, C. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  39. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  40. Ilacqua, N., Anastasia, I., Raimondi, A., Lemieux, P. A three-organelle complex made by wrappER contacts with peroxisomes and mitochondria responds to liver lipid flux changes. Journal of Cell Science. 135 (5), 259091(2022).
  41. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011(2012).
  42. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. 38, 749-767 (2005).
  43. Hsieh, T. S., Chen, Y. J., Chang, C. L., Lee, W. R., Liou, J. Cortical actin contributes to spatial organization of ER-PM junctions. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3171-3180 (2017).
  44. Anastasia, I., Ilacqua, N., Raimondi, A., Lemieux, P. Mitochondria-rough-ER contacts in the liver regulate systemic lipid homeostasis. Cell Reports. 34 (11), 108873(2021).
  45. Cattin, A. L., Burden, J. J., Van Emmenis, L., Mackenzie, F. E. Macrophage-Induced Blood Vessels Guide Schwann Cell-Mediated Regeneration of Peripheral Nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  46. Lopes-da-Silva, M., et al. A GBF1-dependent mechanism for environmentally responsive regulation of ER-Golgi transport. Developmental Cell. 49 (5), 786-801 (2019).
  47. Banushi, B., Forneris, F., Straatman-Iwanowska, A., Strange, A. Regulation of post-Golgi LH3 trafficking is essential for collagen homeostasis. Nature Communications. 7, 12111(2016).
  48. Rey, S. A., et al. Ultrastructural and functional fate of recycled vesicles in hippocampal synapses. Nature Communications. 6, 8043(2015).
  49. Belicova, L., Repnik, U., Delpierre, J., Gralinska, E. Anisotropic expansion of hepatocyte lumina enforced by apical bulkheads. Journal of Cell Biology. 220 (10), 202303003(2021).
  50. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  51. Xu, C. S., Hayworth, K. J., Lu, Z., Grob, P. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 1-36 (2017).
  52. Parlakgül, G., Arruda, A. P., Cagampan, E., Pang, S. High resolution 3D imaging of liver reveals a central role for subcellular architectural organization in metabolism. bioRxiv. , (2020).
  53. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59480(2019).
  54. Kremer, A., et al. A workflow for 3D-CLEM investigating liver tissue. Journal of Microscopy. 281 (3), 231-242 (2021).
  55. Hayat, M. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  56. Wisse, E., Braet, F., Duimel, H., Vreuls, C. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  57. Hanley, J., Dhar, D. K., Mazzacuva, F., Fiadeiro, R. Vps33b is crucial for structural and functional hepatocyte polarity. Journal of Hepatology. 66 (5), 1001-1011 (2017).
  58. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. Microscopy. 1, 6-8 (2010).
  59. Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W., Ramos, I. Three dimensional reconstruction by electron microscopy in the life sciences: An introduction for cell and tissue biologists. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 530-547 (2015).
  60. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235(2018).
  61. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  62. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 369, 67-96 (2007).
  63. Arganda-Carreras, I., et al. Consistent and elastic registration of histological sections using vector-spline regularization. Computer vision approaches to medical image analysis, CVAMIA 2006, Lecture Notes in Computer Science. Beichel, R. R., Sonka, M., et al. 4241, Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 85-95 (2006).
  64. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340(2016).
  65. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  66. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD). Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  67. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).
  68. Xu, C. S., Pang, S., Shtengel, G., Muller, A. An open-access volume electron microscopy atlas of whole cells and tissues. Nature. 599 (7883), 147-151 (2021).
  69. Karabag, C., et al. Semantic segmentation of HeLa cells: An objective comparison between one traditional algorithm and four deep-learning architectures. PLoS One. 15 (10), 0230605(2020).
  70. Heinrich, L., Bennett, D., Ackerman, D., Park, W. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature. 599 (7883), 141-146 (2021).
  71. Kim, J. S., Greene, M. J., Zlateski, A., Lee, K. Space-time wiring specificity supports direction selectivity in the retina. Nature. 509 (7500), 331-336 (2014).
  72. Spiers, H., Songhurst, H., Nightingale, L., de Folter, J. Deep learning for automatic segmentation of the nuclear envelope in electron microscopy data, trained with volunteer segmentations. Traffic. 22 (7), 240-253 (2021).
  73. Hasan, N. M., Gupta, A., Polishchuk, E., Yu, C. H. Molecular events initiating exit of a copper-transporting ATPase ATP7B from the trans-Golgi network. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 36041-36050 (2012).
  74. Stoeck, I. K., Lee, J. Y., Tabata, K., Romero-Brey, I. Hepatitis C virus replication depends on endosomal cholesterol homeostasis. The Journal of Virology. 92 (1), 01196(2018).
  75. Ma, X., Qian, H., Chen, A., Ni, H. M., Ding, W. X. Perspectives on mitochondria-ER and mitochondria-lipid droplet contact in hepatocytes and hepatic lipid metabolism. Cells. 10 (9), 2273(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。