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摘要

TGT表面是研究生长因子整合素串扰的创新平台。灵活的探针设计、粘附配体的特异性以及刺激条件的精确调节，可以对EGFR-整合素相互作用进行可靠的定量评估。结果突出了EGFR作为"机械组织者"调谐整合机制，影响焦点粘附组装和细胞扩散。

摘要

多细胞生物依靠膜受体和周围细胞外基质（ECM）中的同源配体之间的相互作用来协调多种功能，包括粘附，增殖，迁移和分化。机械力可以通过粘附受体整合素 从细胞传递到 ECM中的配体。这些细胞产生的力的量和空间组织可以由生长因子受体调节，包括表皮生长因子受体（EGFR）。目前可用于量化串扰介导的细胞力学变化并将其与局灶性粘附，细胞形态和信号传导相关的工具是有限的。基于DNA的分子力传感器称为张力计系绳（TGT）已被用于量化这些变化。TGT探针的独特之处在于它们既能调节潜在的力阈值，又能以衍射极限的空间分辨率报告整个贴壁细胞表面的皮克牛顿尺度的受体力。这里使用的TGT探针依赖于通过产生荧光信号的受体配体力对DNA双链的不可逆解离。这允许量化细胞的累积积分素张力（力历史）。本文介绍了一种使用TGTs来研究EGFR对整合素力学和粘附形成的影响的协议。TGT机械传感平台的组装系统地详细，并概述了对力，焦点粘连和细胞扩散进行成像的过程。总体而言，调节探针的潜在力阈值，粘附配体以及用于刺激的生长因子的类型和浓度的能力使其成为研究不同膜受体在调节整合素介导的力中的相互作用的强大平台。

引言

细胞具有感知，产生和响应机械力的内在能力，导致细胞表型的变化和局部微环境的重塑1，2。力在调节细胞行为的许多方面起着至关重要的作用，包括粘附，迁移，增殖，分化和伤口愈合3，4。细胞和微环境之间的双向机械交换中的像差可导致患病状态，包括癌症5。许多膜受体参与维持细胞基质稳态;其中，整合素和表皮生长因子受体（EGFR）具有强大的协同作用6，7。传统上，整合素在微环境和细胞内细胞骨架之间建立机械联系，而EGFR调节细胞生长，增殖和存活8，9。EGFR是一个经过高度研究的治疗靶点，专注于促进细胞内信号传导的由外而内的调节。EGFR-整合素串扰已经在遗传和生物化学上建立，以调节多种疾病的进展，包括癌症10，11。虽然研究表明EGFR-整合素相互作用的存在，但结果归因于远离质膜的信号通路7，12，13，14。EGFR或其他生长因子对细胞力学的影响在很大程度上仍未被探索，部分原因是缺乏测量细胞力和信号传导结果的工具。挑战在于确定适当的工具来研究这些并行信号范式之间的通信，并量化它们对细胞力学的具体贡献。

已经开发出几种方法来测量细胞粘附受体产生的力，并且读者被引导到对这些技术的深入评论15，16。简而言之，牵引力显微镜和微柱阵列检测依靠底层基板的变形来推断纳米牛顿（nN）力，比单个受体力多一个数量级17，18。单分子技术，包括AFM和光学镊子，对单蛋白皮牛顿（pN）力敏感，但一次只测量一个受体，不能提供良好的（或任何）空间分辨率。基于DNA的分子张力探针和张力计系绳（TGT）探针提供pN力分辨率和衍射极限（或更好）的空间分辨率，使它们在研究来自不同细胞类型的单细胞力19，20 具有独特的作用，包括成纤维细胞，癌细胞，血小板和免疫细胞21，22，23，24.虽然分子张力探针具有可伸缩的"弹簧"元件，非常适合实时成像，但TGT探针不可逆地破裂，留下荧光"力历史"。TGT还调节底层基质的张力阈值;一系列具有相似化学成分但具有不同断裂力或张力公差（Ttol）的探针可用于量化局灶性粘附形成和细胞扩散所需的最小张力。TGT探针由两条互补的DNA链组成，一条锚定在表面，另一条向细胞提供配体。如果受体结合配体并施加大于探针T托 的力，则链将被分离。Ttol 定义为在理想条件下以2秒间隔破裂50%的探头所需的恒定力。在"导通"TGT探针中，可以将顶部链上的淬灭剂与底部链上的荧光团分离。只有在TGT探针破裂的情况下，可能受到大于或等于Ttol的力，才会产生荧光信号。TGT探针也可以固定，从而可以轻松操作生物系统和测试多种条件。由于这些原因，这项工作中使用了TGT探针。

使用TGT探针来研究如何通过活化的EGFR21调节整合素依赖性细胞粘附和机械力。这项工作使EGFR成为"机械组织者"，调整焦点粘附组织和张力产生。此外，还发现EGF刺激影响局灶性粘附的分布和成熟度，并增强细胞扩散。这种方法可用于未来的研究，以研究生长因子如何影响肿瘤进展和动力学中的机械力。虽然EGFR整合素串扰在调节上皮到间充质转变中的作用已经确定，但机械力在这一过程中的作用仍未得到充分探索10。

这里提出了这些实验的详细方案，包括56 pN TGT探针的合成和组装，玻璃盖玻片上TGT表面的生成，在TGT表面上应用Cos-7细胞并用EGF刺激，用鬼臼素固定和染色细胞，以及抗帕西林抗体，高分辨率全内反射荧光（TIRF）和反射干涉对比显微镜（RICM）成像， 和图像量化。该协议虽然是为了研究Cos-7细胞的EGF刺激而编写的，但很容易适应许多基于TGT的实验。不同的配体，Ttol，细胞类型，刺激参数，固定后标记的蛋白质和定量分析可以很容易地被取代，这使得该方案强大且广泛可用。

研究方案

1. TGT寡核苷酸制备

注意:这里概述了寡核苷酸探针合成的细节。请注意，一些修改和纯化步骤可以外包用于定制合成。

  1. 将环[阿根廷-Gly-Asp-D-Phe-Lys（PEG-PEG）]肽的伯胺与张等人22 描述的叠氮化物-NHS连接子一起激活，方法是在最终体积为10μL二甲基甲酰胺的1:1.5比例（100:150nmoles）中混合。加入0.1μL有机碱三乙胺，并在4°C下孵育12小时。
  2. 使用0.1 M TEAA（溶剂A）和100%乙腈（溶剂B）通过反相HPLC纯化产物，流速为1mL / min，10%溶剂B的初始条件设定在0.5%/分钟的梯度下。结合洗脱的峰（203nm处的吸光度）并通过MALDI-TOF质谱进行验证。该产品是氯化碳基苯叠氮化物。
  3. 为了生成TGT顶链，将cRGDfK-叠氮化物和炔基-21-BHQ2寡核苷酸（TGT顶链:5己炔基/GTGAAATACCGATGCAGG/3BHQ_2）以2:1的比例（͂200μM:100μM）与100μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）与5mM抗坏血酸钠和0.1μM预制的Cu-THPTA中混合。让反应在室温（RT）下进行至少4小时或在4°C下过夜。
  4. 通过P2脱盐凝胶处理混合物以除去多余的染料，副产物，有机溶剂和未反应的试剂。用650μL预水合P2凝胶准备离心柱，方法是将其以18，000× g 旋转1分钟。丢弃流过的液体并加入反应混合物。再次以18，000 x g 旋转1分钟并收集流过。用超纯水将反应混合物的最终体积降至300μL。
    注意:用水预水合P2凝胶6小时。
  5. 通过反相HPLC纯化脱盐的反应混合物。用于这种纯化的有机溶剂包括H2O（溶剂A）中的0.1 M TEAA和100%MeCN（溶剂B，或流动相）。
    1. 在注入混合物之前，以10%溶剂B的初始条件以1%/min的梯度平衡色谱柱。将流速调节至 1 毫升/分钟。用500μL注射针将反应混合物注入HPLC回路。
    2. 通过可视化DNA在260nm处的峰吸收和BHQ2淬灭剂在560nm处的峰值吸收来收集产物。将洗脱产物在真空离心浓缩器中干燥过夜。
  6. 采用亲核取代将TGT底链偶联到Cy3B-NHS酯上，如Ma等人所述。25.将100微米的56 pN TGT底链（5生物素/ΒTTT/iUniAmM/CGCTGTGGT）与50微克预溶于10μLDMSO中的Cy3B-NHS酯混合。用0.1 M碳酸氢钠将此混合物的pH值调节至9，并用1x PBS将最终体积降至100μL。将反应混合物在室温下孵育过夜。
  7. 使用P2凝胶过滤和反相HPLC依次纯化混合物，以分离未反应的试剂，盐和有机溶剂（在步骤1.4和1.5中描述）。
  8. 通过使用分光光度计记录其在260nm处的吸光度来估计纯化的寡核苷酸染料偶联物的浓度。
  9. 通过马尔迪-TOF质谱表征纯化产物。将过量的3-羟基吡啶甲酸溶解到TA50溶剂（50:50 v / v乙腈和ddH2O中0.1%TFA）中以制备新鲜的MALDI基质。标记产品的估计和测量分子量为:cRGDfK-1-BHQ2 - 8157.9（计算），8160.1（发现）;Cy3B 标记为 56 pN TGT - 10272.7（计算结果），10295.8（已找到）。
  10. 将顶部和底部链分别溶解在浓度在30-50μM之间的无核酸酶水中，使用不含DNA酶的移液器吸头以避免库存污染。储存在4°C下用于短期应用，或在-20°C下用于长期应用。寡核苷酸的稳定性不受反复冻融循环的影响。

2. 表面处理

第1天:

  1. 将 25 mm 玻璃盖玻片（最多 8 个）放入聚四氟乙烯机架中。将培养架放入装有 40 mL 200 证明乙醇的 50 mL 硼硅酸盐烧杯中。用石蜡膜覆盖烧杯，以避免水进入，并在室温下以35 kHz的工作频率超声处理10-15分钟（图1A）。
  2. 在 50 mL 烧杯中加入 40 mL 食人鱼溶液，该溶液是通过将硫酸和过氧化氢以 3:1 的比例混合在吡咯烧杯中新鲜制备的。用玻璃移液器搅拌。将盖玻片架转移到烧杯中，并在通风橱中室孵育30分钟以蚀刻盖玻片表面（图1B）。
    注意:穿戴全套个人防护用品，包括实验室外套、手套和护目镜，并在化学通风橱中工作。缓慢地将过氧化氢加入到酸中，以防止溶液过热。
  3. 蚀刻后，使用镊子将盖玻片架转移到装有超纯水的烧杯中。以15 s的间隔重复此步骤六次，以完全中和酸（图1C）。
    注意:将食人鱼溶液留在化学通风橱中过夜，然后将其丢弃到酸性废物容器中。
  4. 目视检查盖玻片，以确保表面看起来干净，玻璃表面上没有图案或灰尘颗粒。如果检测到图案或灰尘，请重复步骤2.1-2.4。
    注意:通过将处理过的盖玻片浸入水中并垂直移除来测试表面亲水性。与未经处理的盖玻片形成斑块相比，处理过的盖玻片上的水会以均匀的薄片形式消退以形成杨氏环。
  5. 将盖玻片架转移到装有200乙醇的烧杯中，洗涤两次，持续15秒，使表面平衡成有机溶剂。将盖玻片架转移到具有3%APTES的200证明乙醇溶液中，在室温下1小时使盖玻片硅烷化（图1D）。用石蜡膜覆盖烧杯。
    注意:APTES沉积参数因表面清洁方法、溶剂含水量、APTES浓度、孵育时间和退火温度而异。
  6. 将机架浸入装有200证明乙醇溶液的干净烧杯中。重复此洗涤三次，每次15秒（图1E）。
  7. 使用低出口压力的氮气（N2）干燥盖玻片。将盖玻片放入10厘米的聚苯乙烯培养皿中，其中有一块石蜡膜平放。确保盖玻片干燥并分离（图1F）。
  8. 将100μL 2mg / mL NHS生物素溶液加入DMSO中，加入到放置在石蜡膜上的四个盖玻片中。将其他四个盖玻片放在顶部（两个盖玻片彼此相对，功能化溶液之间）设置一个"三明治"，并将培养皿在4°C下孵育过夜（图1G）。
    注意:在4°C时，NHS试剂更稳定，这有助于均匀的表面官能化。此外，三明治还可节省试剂。避免在三明治中添加多余的溶液，因为它可能会泄漏并导致盖玻片滑落。

第2天:

  1. 将盘子从4°C中取出，分离夹在中间的盖玻片。如图 2A 所示，使镀膜表面彼此朝向，定位机架中的滑道。用200证明的乙醇溶液洗涤三次，每次15秒。用N2 气体干燥，并将它们放入装有石蜡膜的新培养皿中。
    注:按照指示定向盖玻片有助于识别功能化表面。
  2. 用1 mL 1x PBS洗涤盖玻片三次，以使其平衡回水相。向每个盖玻片中加入800μL 0.1%牛血清白蛋白（BSA）在1x PBS（w / v）中，并在RT下孵育30分钟以钝化表面并阻断后续功能化试剂的非特异性结合（图2B）。
  3. 孵育后，用1 mL 1x PBS洗涤盖玻片三次。在室温下在1x PBS中加入800μL1μg/ mL链霉亲和素45-60分钟，以使盖玻片功能化（图2C）。
    注:保留一个不含链霉亲和素的盖玻片以验证钝化效率（可选）。使用实验条件添加10 nM生物素化分子和图像。此表面强度应接近相机的暗噪点。
  4. 与步骤2.11同时，使用热循环仪在PCR管中以50nM的最终浓度在100μL的1M NaCl中组装TGT探针（顶部:以1:1摩尔比的底部链）。在95°C下解离链5分钟，并通过将温度降低至25°C并保持25分钟来逐渐退火（图2D）。避免 TGT 探头长时间暴露在光线下。
  5. 链霉亲和素孵育后，使用1x PBS洗涤盖玻片三次。将100μL预组装的TGT探针加入其中四个盖玻片中，并使用剩余的4个盖玻片制作三明治，功能化侧朝向探针（八个表面需要四管杂交TGT探针）。用铝箔覆盖并在室温下孵育1小时，以允许探针与表面结合（图2E）。
  6. 孵育后，将三明治分开，并用1x PBS清洗盖玻片三次。TGT 表面现在已准备好进行成像。小心地将盖玻片组装到预清洁的成像室中，并加入1x PBS以保持表面水合（图2F）。
    注意:过度拧紧腔室会使表面破裂。防止表面干燥。

3. 细胞制备和染色

  1. 为了研究表皮生长因子（EGF）刺激对Cos-7力学，粘附和细胞扩散的影响，用0.05%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化Cos-7细胞2分钟。通过用HBSS洗涤并以800× g 离心5分钟来中和胰蛋白酶。再次重复中和步骤。
  2. 在杜贝克科的改性鹰培养基（DMEM）中组装的TGT表面上以4 x 104 个细胞的密度平板细胞，并补充50 ng / mL EGF或不含EGF的DMEM。让细胞在37°C下在细胞培养箱中用5%CO2 扩散60分钟（图3A）。
    注意:细胞在没有血清的情况下在DMEM中孵育，以避免生长因子的刺激。将EGF在10 mM乙酸中稀释以制成1mg / mL的储备。它在DMEM中以50 ng / mL的速度用于成像实验。
  3. 孵育后，用1x PBS洗涤细胞三次，并在室温下用2mL 4%多聚甲醛固定12分钟（图3B）。
    注意:所有孵育步骤均在旋转摇床上以~35 rpm的速度进行，以使溶液均匀分布。通过覆盖TGT表面直到它们准备好成像来保护它们免受光线照射。
  4. 抽吸固定剂并用1x PBS在室温下以5分钟间隔洗涤盖玻片5次，任选地，将盖玻片与50mM NH4Cl在1x PBS中在37°C下孵育30分钟以淬灭多聚甲醛相关的自发荧光，并以5分钟间隔用1x PBS洗涤三次（图3B）。
  5. 加入缓冲液A（1x PBS，5%正常马血清，5%正常山羊血清，1%BSA，0.025%曲肽X-100）并在37°C下孵育30分钟以阻断和透化细胞。每隔5分钟用1x PBS洗涤三次（图3B）。
  6. 将带有盖玻片的成像室放在湿度容器中。在封闭缓冲液（1x PBS，5%正常马血清，5%正常山羊血清，1%BSA，0.005%Triton x-100）中以1:250稀释原代抗帕西林抗体（局灶性粘附标志物）。在每个盖玻片下与200μL一抗溶液在37°C下孵育2小时（图3B）。
    注意:不要让表面变干。
  7. 用1x PBS每隔5分钟洗涤盖玻片五次，然后将其返回到湿度容器中。同时用染料偶联的山羊抗兔二抗混合物以1:800稀释和染料偶联的鬼笔环蛋白（肌动蛋白）的混合物在200μL封闭缓冲液中以1:400稀释每个盖玻片。在37°C孵育60分钟（图3B）。
  8. 以5分钟间隔用1x PBS洗涤表面五次，并在4°C下储存，直到准备好成像（图3B）。
    注意:在表面处理后3天内对图像样品进行图像处理，以避免信号衰减。

4. 图像采集

  1. 在具有488，561和647 TIRF激发，RICM激发，完美对焦系统和数码相机的倒置显微镜上使用具有高数值孔径（1.49）的油浸式60x物镜。
    1. 向物镜中加入油，清洁样品室的盖玻片底部，然后将样品放在载物台上。专注于细胞并吸引完美的焦点。
  2. 将显微镜置于RISM成像模式，并去除发射滤光片，将GFP滤光片立方体移除。通过关闭落射照明光圈光圈并使之居中来对齐RICM。
  3. 将显微镜置于TIRF模式，激光激发和四通TIRF滤光片立方体。将488 nm激光聚焦到房间天花板上的一个小点上，并增加入射角直至超过临界角，同时以实时模式监控摄像机上的荧光。观察背景荧光的急剧减少和超过临界角时单个聚焦平面。
    注意:TIRF激发最靠近样品盖玻片界面的薄区域（~100 nm），突出显示开放的TGT探针和焦点粘连，同时消除细胞内的失焦荧光。如果TIRF不可用，可以使用落射荧光;但是，信噪比会更低。
  4. 使用 RICM 的相机的"实时"模式识别要成像的细胞。
  5. 获取肌动蛋白（640 nm ex）、整合素张力（561 nm ex）和帕西林（488 nm ex）的 RICM 图像和 TIRF 图像。使用200 ms的曝光时间按顺序获取图像。
    注意:曝光时间取决于许多因素，包括物镜、激光功率、发射滤光片和相机灵敏度。信号应至少比背景大 2 倍。背景在1000 AU左右，因此信号应至少为2000-3000 AU。
  6. 对至少30个细胞重复4.4-4.5。更改封面单，对焦，然后重复4.4-4.5。

5. 数据分析

注:使用斐济软件进行定量图像分析，并使用统计软件进行分析。

  1. 打开一个单元格的图像集。
  2. 通过使用 ImageJ 手绘 选择工具跟踪 RICM 图像中单元格的边界，创建单元格区域的蒙版（RICM 蒙版）。将感兴趣区域 （ROI） 保存到 ROI 管理器（分析>工具> ROI 管理器）（图 4A1，2）。
  3. 在积分张力图像中选取单元格外的代表性区域，并绘制至少 200 x 200 像素的 ROI。从ROI中排除任何其他细胞或荧光碎片。使用测量工具测量ROI中的背景荧光（分析>测量）（图4A3）。
  4. 从张力图像中减去步骤5.2中获得的平均背景荧光（处理>数学>减去）（图4A4）。
  5. 使用在步骤5.2中建立的RICM掩模来定义单元封装内的张力信号（ROI管理器>选择>应用掩模>编辑>清除外部）（图4A5）。
  6. 使用黄的自动阈值方法（图像>调整>阈值）为张力图像创建阈值蒙版（图4A6）。确保阈值掩码最能代表生成的积分张力区域。根据经验，将阈值设置为平均背景荧光的2倍。
  7. 创建阈值张力蒙版的选择（编辑>选择>创建）（图4A7）。
  8. 将所选掩模转移到步骤5.4中生成的张力图像上，并测量打开探头的集成强度（ROI管理器 > 选择 （张力掩模）> 分析 > 测量 > RawIntDen）（图4C）。
  9. 从 RICM 掩模（ROI 管理器>选择（RICM 掩模）>应用掩模>分析>测量）测量细胞形态学属性面积、圆度和长宽比（图 4B）。
  10. 通过选择张力掩模图像并应用RICM掩模（ROI管理器 > 选择 （RICM掩模）> 分析 > 测量 > %面积）来测量机械破裂密度，定义为破裂探头的细胞足迹百分比（图4C）。
  11. 将测量值导出以进一步分析和可视化到统计软件中。
  12. 对每个单元格重复 5.1-5.11。

结果

采用开启TGT探针研究配体活化表皮生长因子受体（EGFR）对Cos-7细胞21中整合素介导的细胞力学和粘附形成的影响。探针呈配体环状银杏皮-Phe-Lys（cRGDfK）21，23，25，26，对整合素异源二聚体αVβ3具有选择性，对α5β1整合素27，28，29，30仅具有很小的亲和力。TGT探针包括一个双链DNA，该DNA通过使用生物素 - 链霉亲和素结合 通过 底链链官能化到玻璃盖玻片表面上。顶部链显示整合素配体，可用于与细胞膜上的同源整合素受体结合（图5A）。底部链用荧光团标记，顶部链用淬灭剂标记，当双相TGT完好无损时，导致最小的背景荧光。如果整合素结合配体并施加大于探针Ttol 大小的力，则DNA双链体将分离导致荧光（图5A）。任何未被机械力破坏的TGT探针都将保持非荧光。这种力选择性导通荧光允许在衍射极限分辨率下对pN尺度积分素产生的力进行系统和定量映射。TGT探头还调节基材的张力阈值。

这里显示的是 TGT 表面的代表性示例，其 Ttol 为 56 pN。将Cos-7细胞接种在该TGT表面上，有或没有EGF刺激，以研究配体刺激的EGFR活化对细胞粘附和整合素力学的影响（图5A，B）。将细胞与或不伴有EGF在TGT表面孵育60分钟，固定并免疫染色以显示局灶性粘附分布（paxillin）和细胞骨架（F-肌动蛋白）的组织（图5B）。然后使用RICM和TIRF显微镜对细胞进行成像。正如在RICM图像中清晰可见的那样，与不刺激相比，EGF刺激显着增强了56 pN TGT表面上的Cos-7细胞扩散。通过从RICM图像中测量细胞 - 底物接触区域的大小，对每种条件下的50个细胞进行定量（图5C）。用EGF刺激导致更循环的形态，代表Cos-7细胞在其自然生理环境中扩散和生长（图5D）。在张力荧光图像中观察到的EGF刺激下，来自开放探针的荧光也更高。与不使用EGF刺激相比，开放探头的集成强度与开放探头的数量成正比（图5B，E）。这是所有受体 - 配体接合的表示，其中整合素施加的力大于Ttol （56 pN）。

用帕西林染色表明，局灶性粘连的分布、数量、成熟度（大小）和组织也受到EGF刺激的影响。与没有EGF对照组相比，EGF刺激细胞中的局灶性粘连似乎更成熟和径向定向。F-肌动蛋白细胞骨架组织也通过EGF刺激得到增强，如鬼瘠染色所评估的那样（图5B）。这些定性评估是通过对两个治疗组的图像进行视觉比较而进行的。可以对局灶性粘连进行定量分析，但超出了本方案的范围。在该实验中，TGT表面提供了一个平台，可以系统地详细描述EGFR活化对细胞扩散，整合素力学和局灶性粘附形成的影响。

figure-results-1854
图 1:TGT 表面处理第 1 天的示意图。 （A） 清洁盖玻片。（B） 蚀刻盖玻片表面。（C）中和食人鱼解决方案。（D）使表面硅烷化，制成活性胺基团。（E） 将盖玻片平衡到有机相。（F）用惰性气体干燥盖玻片。（G）生物素化表面胺基团。 请点击此处查看此图的大图。

figure-results-2403
图2:TGT表面制备第2天的示意图 （A）清洁并干燥盖玻片以除去前一天的任何残留生物素。（B）用BSA钝化以防止试剂在后续步骤中的非特异性结合。（C）用链霉亲和素使盖玻片功能化。（D）在热循环仪中杂交探针。（E）将合成的探针应用于盖玻片（F）在细胞成像室中组装盖玻片。 请点击此处查看此图的大图。

figure-results-2951
图 3:一般工作流程，重点介绍了整个实验装置中的广泛步骤（A） 在基础培养基 （DMEM） 中 TGT 表面上进行细胞分离和电镀的过程，无论是否进行 EGF 刺激。（B）在TGT表面上附着和扩散后进行固定和免疫染色的步骤的流程图。（C）染色后，使用RICM和TIRF显微镜在倒置荧光显微镜上对细胞进行成像。请点击此处查看此图的大图。

figure-results-3466
图4:数据处理和定量分析的示例 （A）斐济用于RICM和张力图像量化的分析管道的分步细分（ImageJ）。（B）使用上述管道分析的细胞形态学结果的代表性示例。（C）使用上述管道分析的细胞力学结果的代表性示例。 请点击此处查看此图的大图。

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图5:来自TGT实验的示例数据（A）突出显示细胞膜-TGT表面界面处接触区的图。插入投射与其同源配体cRGDfK相互作用的整合素，具有（右）或不伴（左）EGF刺激。（B）在56 pN TGT表面上扩散的Cos-7细胞的RICM和TIRF图像。电镀后60分钟获得图像，有或没有EGF刺激。显示单个 RICM（获得性）、整合素张力（灰度）、帕西林（橙色热）和 F-肌动蛋白（蓝绿色）图像，并覆盖两种刺激条件。比例尺:10微米。插图突出显示了放大的ROI（感兴趣区域），详细说明了在以paxillin为标记的粘附形成位点处生成的整合素张力的共定位，以及以肌动蛋白标记的潜在亚细胞骨架组织。比例尺:5微米。（中英）扩散面积（RICM细胞足迹）（C），圆度（D）和Cos-7细胞的积分张力（E）的散点图，有或没有EGF刺激。条形表示平均± s.d.使用学生的t检验对组之间的差异进行统计学评估;P < 0.0001。n = 三个独立实验中的50个细胞。请点击此处查看此图的大图。

figure-results-4810
图 6:具有不同可能问题的 TGT 表面示例。 （A）理想TGT表面的张力和RICM图像，在细胞粘附之前淬灭组装的探针。（B）TGT探头缺少顶部链（淬灭器）的TGT表面的张力和RICM图像。张力图像显示来自底部链中开放荧光团的均匀荧光。（C）在理想TGT表面上扩散的细胞的张力和RICM图像。（D）张力和RICM图像，用于在制造不良的TGT表面上传播的细胞，钝化有限或探针降解。（E）用cRGDfK配体接种在理想表面上的细胞的张力，RICM和明场图像表明cRGDfK-整合素相互作用对于细胞附着和张力产生至关重要。（F）在TGT上镀在没有cRGDfK配体的表面上的细胞的张力，RICM和明场图像。虽然在明场图像中可以看到细胞，但没有观察到细胞附着或产生的整合素张力。比例尺:10微米。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

通过上面概述的详细分步程序，可以制备TGT表面以量化贴壁细胞在EGF处理后细胞附着和扩散期间产生的细胞形态和整合素张力。简单的探针设计、合成和表面制备以及简单的实验设置为研究EGFR和整合素的相互作用提供了一个稳定的平台。总体而言，结果验证了EGFR的配体依赖性激活可增强细胞扩散，调节整合素受体的受力特性，并促进局灶性粘附组织和成熟。使用TGT探针获得的结果支持了一个总体假设，即生长因子（如EGFR）充当"机械组织者"，增加了整合素张力的数量和空间组织，并调节了局灶性粘连的方向和机制。

在施用于TGT表面时，细胞随着整合素（αVβ3）受体感知并结合到cRGDfK配体而着陆，附着和扩散。在此过程中，TGT探针可以机械破裂，在配体接合位点产生荧光。读数是细胞与表面相互作用的累积"力历史"。在这些实验过程中，TGT表面可能存在一些常见问题。高表面背景荧光（图6A，B），斑片状表面外观，细胞无法产生张力信号（图6C，D），以及细胞扩散失败（图6E，F）可能是由于TGT探针或表面合成的技术缺陷。 表 1 中提供了这些常见问题的解决方案。

TGT探针的简单设计为细胞生物学家提供了一个强大的工具，通过仅提供特定的配体和刺激，可以单独研究特定的生长因子 - 整合素信号传导结果，而不会受到其他细胞表面受体的干扰。此外，TGT探针允许在pN灵敏度下研究细胞粘附期间单个整合素受体的张力阈值。替代方法无法报告固定样品中具有高空间分辨率的单个受体施加的力31.牵引力显微镜仅对nN力敏感，比单个整合素受体15施加的力高出一个数量级，分子张力探针测量pN力，但由于它们是可逆的，它们不能牢固地承受固定。由于这些原因，TGT探针是研究生长因子 - 整合素相互作用机制的有吸引力的工具。

在设计实验之前，应考虑与TGT探针相关的几个技术细微差别。张力图像是时间上的快照，代表力历史，而不是任何给定时间点受体配体啮合的指标。由于信号生成取决于探针分离，因此TGT荧光来自开放的探针，而不是受体 - 配体参与的活性张力。这意味着在TGT表面上获得的积分张力读数是历史性的和累积性的，代表了存在大于Ttol的力的地方;当前受体配体力小于Ttol 的位置没有报道19，32。由于TGT破裂导致受体 - 配体参与终止，细胞扩散是由于整合素 - 配体相互作用经历低于Ttol的力。因此，用户在定义电镀后的时间时必须小心，以估计与基于整合素的粘附相关的机械结果。最后，必须考虑Ttol 的含义。这里采用的TGT探头的T至l 为56 pN，其中Ttol 是施加2秒时使50%的探头破裂所需的恒定力。在考虑复杂的生物系统时，TGTs可能会经历具有不同时间依赖性的异质性和多样化的力级变。如果TGT被大于Ttol的力破坏，荧光将低估总张力。或者，施加较长时间的低于Ttol 的力可以破裂与施加较短时间的高阈值力相似数量的探头。这两种情况都可能导致相同的荧光强度读数，使得使用TGT探针33，34难以解析确切的张力幅度或动力学。

总体而言，应通过设计内部对照实验，比较其他基质涂层表面上的扩散轮廓，在存在或不存在生长因子刺激的情况下对细胞中的TGT荧光进行平行评估，以及使用具有不同TT的TGT来仔细评估与生长因子刺激的整合素张力.TGTs允许量化生长因子信号传导在调节整合素受体的机制，局灶性粘附动力学和细胞扩散中的作用。该协议可用作许多基于TGT的实验的模板，使用具有不同Ttol，不同配体，不同细胞类型或不同刺激条件的探针。任何感兴趣的蛋白质都可以在固定后标记，并且可以实现任何类型的定量图像分析。因此，我们为许多TGT实验提供了一个模板。

TGT探针的使用不仅限于研究整合素，还可以通过修饰配体扩展到不同细胞类型的各种细胞膜受体阵列。TGT探针已被用于研究力在调节各种受体信号级联中的作用，包括鉴定Notch受体力学在胚胎发育和神经发生35中的机械作用，B细胞受体36介导抗原鉴定和内化的力，以及T细胞表面受体的机械校对能力，以检测力的变化以提高信号转移的强度和特异性37.总之，这些发现突出了TGT探针在各种实验环境中的巨大潜力。

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者希望表彰马修斯实验室的成员进行富有成效的讨论和批评。我们感谢从NSF CAREER 1832100和NIH R01GM131099向A.L.M.提供资金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilaneMillipore Sigma440140Surface Preparation
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)Millipore Sigma56197Maldi-TOF-MS matrix
Acetic Acid, GlacialFisher ScientificA38SDiluting EGF
Acetonitrile (HPLC)Fisher ScientificA998SKOligonucleotide Preparation
Alexa Fluor 488 PhalloidinCell Signaling Technology8878SImmunocytochemistry
Ammonium ChlorideFisher ScientificA687Immunocytochemistry
Anti-Paxillin antibody [Y113]Abcamab32084Immunocytochemistry
BD Syringes only with Luer-LokBD bioscience309657Surface Preparation
Bio-Gel P-2Bio-Rad1504118Oligonucleotide Preparation
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free PowderFisher ScientificBP9703100Surface Preparation
Cos-7 cellsATCCCRL-1651Cell Culture, Passage numbers 11-20
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784Surface Preparation
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acidVivitidePCI-3696-PIOligonucleotide Preparation
Cy3B NHS esterGE HealthcarePA63101Oligonucleotide Preparation
DimethylformamideMillipore SigmaPHR1553Oligonucleotide Preparation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium PyruvateFisher ScientificMT10013CCell Culture
Epidermal Growth Factor human EGFMillipore SigmaE9644Cell Culture
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22032601Surface Preparation
Falcon Standard Tissue Culture DishesFisher Scientific08-772ESurface Preparation
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10-438-026Cell Culture
Flurobrite DMEMFisher ScientificA1896701Cell Culture
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21244Immunocytochemistry
Goat SerumFisher Scientific16-210-064Immunocytochemistry
Hank’s balanced salts (HBSS)Fisher Scientific14-170-161Cell Culture
Horse SerumFisher Scientific16050130Immunocytochemistry
Hydrogen PeroxideFisher ScientificH325-500Surface Preparation
Nanosep MF centrifugal devicesPall laboratoryODM02C35Oligonucleotide Preparation
NHS-azideFisher Scientific88902Oligonucleotide Preparation
Nitrogen Gas CylinderAirgasSurface Preparation
No. 2 round glass coverslips - 25 mmVWR48382-085Surface Preparation
Parafilm M Laboratory FilmFisher Scientific13-374-10Surface Preparation
Paraformaldehyde 16%Fisher Scientific50-980-487Immunocytochemistry
PBS, 1XFisher Scientific21-030-CVSurface Preparation/Immunocytochemistry
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)Fisher Scientific15-070-063Cell Culture
PYREX Low Form Griffin BeakersFisher Scientific02-540GSurface Preparation
Sodium AscorbateFisher Scientific18-606-310Oligonucleotide Preparation
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233Oligonucleotide Preparation
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358Surface Preparation
StreptavidinFisher Scientific434301Surface Preparation
Sulfo-NHS-LC-BiotinFisher Scientific21335Surface Preparation
Sulfuric AcidFisher ScientificA300-500Surface Preparation
TEAAFisher ScientificNC0322726Oligonucleotide Preparation
TriethylamineMillipore Sigma471283Oligonucleotide Preparation
Trifluoroacetic Acid (TFA)Fisher ScientificPI28901Oligonucleotide Preparation
THPTAFisher ScientificNC1296293Oligonucleotide Preparation
Triton X 100 Detergent Surfact Ams SolutionFisher Scientific85111Immunocytochemistry
Water, DNA Grade, DNASE, Protease freeFisher ScientificBP24701Oligonucleotide Preparation
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μmAgilent653950-702Oligonucleotide Preparation
High-performance liquid chromatographyAgilent1100Oligonucleotide Preparation
Low Speed Orbital ShakerFisher Scientific10-320-813Immunocytochemistry
Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)Voyager STROligonucleotide Preparation
Molecular Probes Attofluor Cell ChamberFisher ScientificA7816Surface Preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherOligonucleotide Preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscopepe NikonMicroscopy
Nikon Perfect Focus SystemNikonMicroscopy
NIS Elements softwareNikonMicroscopy
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS cameraHamamatsuMicroscopy
Quad band TIRF 405/488/561/647 cubeCHROMAMicroscopy
RICM CubeCHROMAMicroscopy
SOLA v-nIR Light EngineLumencorMicroscopy
Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 IncubatorFisher ScientificCell Culture
VWR 75D Ultrasonic CleanerVWR13710Surface Preparation
Data AnalysisUse
Fiji (Image J)https://imagej.net/software/fiji/downloadsQuantitative Analysis
Graph Pad PrismGraph PadStatistical Analysis
Oligo name5'modification/ 3' modificationSequence (5' to 3')Use
Alkyne-21-BHQ25' Hexynyl/ 3' BHQ_2GTGAAATACCGCACAGATGCGTop strand TGT probe
56 pN TGT5' Biosg/TTTTTT/iUniAmMCGCATCTGTGCGGTATTTCACTTTBottom strand TGT probe
12 pN TGT5' AmMC6/ 3' BioTEGCGCATCTGTGCGGTATTTCACTTTBottom strand TGT probe

参考文献

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