新生小鼠左心室结构、功能和冠状动脉血流的超声心动图表征

摘要

本协议描述了7日龄新生小鼠左心室形态，功能和冠状动脉血流的超声心动图评估。

摘要

超声心动图是一种非侵入性程序，可以评估心血管疾病动物模型中的结构和功能参数，并用于评估临床前研究中潜在治疗的影响。超声心动图检查通常在年轻成年小鼠（即4-6周龄）中进行。由于小鼠幼崽体积小和相关的技术困难，通常不进行早期新生儿心血管功能的评估。最重要的挑战之一是幼崽四肢的短长度阻止它们到达超声心动图平台中的电极。体温是另一个挑战，因为幼崽非常容易受到温度变化的影响。因此，建立对小小鼠幼崽进行超声心动图研究的实用指南非常重要，以帮助研究人员检测早期病理变化并研究心血管疾病随时间的进展。目前的工作描述了在7天大的早期小鼠幼崽中进行超声心动图的方案。还描述了新生小鼠心脏形态、功能和冠状动脉血流的超声心动图特征。

引言

该方案的总体目标是使用超声心动图检查 7 天大的新生小鼠幼崽的心脏形态、功能和冠状动脉血流。该技术开发背后的基本原理是确定心脏病小鼠模型中冠状动脉血流和心脏功能的早期变化¹。超声心动图的非侵入性是有利的，因为它允许研究人员评估生理条件下的心血管功能，并为研究人员研究治疗心血管疾病的靶向疗法提供了筛查工具^2，3。传统上，超声心动图研究是用年轻成年小鼠（4-6周）进行的;然而，一些小鼠模型（即转基因模型）在这个年龄已经表现出病理变化和心功能障碍。因此，使用动物模型的心脏研究主要集中在改善或治疗心功能障碍的治疗药物上。相比之下，最近，研究工作已转向关注心脏病的预防措施和早期干预⁴。

以前的研究已经描述了使用超声心动图测量新生小鼠心肌梗死模型中的心脏功能^5，6;然而，这些研究未能测量冠状动脉血流，最重要的是，未能在手术过程中记录心电图（ECG）和心率（HR）数据，很可能是由于幼崽的四肢尺寸小，无法到达电极垫。我们在本协议中通过将铝箔连接到四肢以使它们能够到达电极垫并创建ECG电路来克服这个问题。此外，该协议描述和表征新生小鼠的冠状动脉血流。

本研究在胸骨旁长轴和短轴视图中获得了B型和M型图像，以测量结构和功能参数^2，3。形态学参数包括左心房尺寸、左心室尺寸、左心室壁厚、左心室质量、相对壁厚（RWT）。功能参数包括射血分数（EF）、分数缩短（FS）、心输出量（CO）和周向纤维缩短速度（Vcf）。脉搏波（PW）多普勒用于测量胸骨旁短轴（PSAX）视图的主动脉血流和心尖四腔视图中的二尖瓣血流。顶端四腔视图也用于在二尖瓣环的间隔部分进行组织多普勒。左前降（LAD）冠状动脉的冠状动脉血流也使用改良的胸骨旁长轴（PLAX）视图进行检查。冠状动脉血流储备（CFR）是在异氟醚浓度增加引起的应力挑战后计算的。

目前的协议表明，超声心动图研究可以在新生儿小鼠的早期进行，从而允许早期识别心脏病态和不同小鼠模型中左心室血流动力学和冠状动脉血流参数的纵向随访研究。该技术可用于研究遗传改变或药物干预在出生后早期心脏功能中的作用。此外，该协议为确定生命早期心脏病的发作提供了有价值的工具，从而使研究人员能够解锁不同小鼠模型中心脏病初始阶段的分子机制。

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研究方案

所有实验均获得伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理和使用委员会的批准。对于实验，使用7天龄的FVB / N小鼠。该方案分为小鼠制备、超声心动图图像采集和成像后动物护理。

1. 小鼠准备

1. 从繁殖笼中获取7日龄的小鼠。
   注意:在这个早期，很难通过体检来确定动物的性别。
2. 将ECG凝胶（见 材料表）放在加热的平台电极垫上。将铝箔条（~1.5 英寸 x 0.25 英寸）放在电极垫的顶部，以扩大电极范围并用胶带固定（图 1A）。随后，将ECG凝胶放在铝箔条的顶部。
   注意: 确保铝箔条下方的凝胶在手术过程中不会变干.如果发生这种情况，请添加更多凝胶以保持导电性。
3. 从丁腈手套上切出一根手指，使其覆盖一侧的异氟烷/氧气鼻锥和另一侧的小鼠鼻子（图1B）。
4. 将小鼠幼崽放入异氟烷诱导室中，并在100%氧气的驱动下以2.5%浓度开始异氟烷递送（图1C）。
5. 将麻醉的小狗仰卧在成像平台上，爪子放在铝箔垫的顶部并用胶带固定。确保电路完整且心电图正在记录。
6. 将异氟醚输送减少到1.5%，由100%氧气驱动。用胶带将切出的手指从手套上固定在幼犬鼻子周围。通过捏小狗的爪子来确认麻醉深度。
7. 在幼犬的上半身顶部放置一层厚厚的预热超声凝胶。使用两个纱布卷将超声凝胶保持在适当的位置（图1D）。
8. 使用加热灯保持幼犬的正常体温（图 1E）。
   注意:由于幼犬的体积小，在当前的研究中没有使用直肠探针来监测体温。

2. 超声心动图图像采集与分析

1. 使用配备有线性阵列换能器的超声心动图仪器进行经胸超声心动图检查，B模式为40 MHz，多普勒为32 MHz（帧速率233）（参见材料表），遵循成年小鼠超声心动图协议⁷，^8，9。
2. 在超声心动图图像采集过程中放置回声换能器时，避免对幼犬的胸腔施加过大的压力。
   注意:由于幼犬的体积小，换能器本身的重量可能会导致心脏功能改变或死亡。
3. 捕获左心室流出道和左心房的 PLAX 视图。
   1. 将换能器放在支架中，索引标记朝向小狗的右肩。
   2. 降低换能器，直到它与凝胶接触，并在B模式下观察左心室流出道（图2A）。
   3. 在主动脉瓣使用M模式测量收缩末期左心房（LA）最大直径（图2B，表1）。按 电影存储 按钮记录数据。
4. 捕获左心室的 PSAX 视图以测量腔室尺寸、壁厚、主动脉血流和肺血流。
   1. 将换能器顺时针旋转 ~90° 以获得 PSAX 视图。
   2. 将探头放在肌水平，并使用M模式测量收缩期和舒张期的左心室内径（LVID），室间隔厚度（IVS）和PW（图3A，表1）。按 电影存储 按钮记录数据。
   3. 使用舒张腔尺寸计算 RWT，一种肥大指数，如下所示^3，10:
      （舒张末期的PW + IVS）/（舒张末期的LVID）
   4. 将换能器移向心脏底部，并使用彩色多普勒观察肺动脉。按 PW多普勒 以量化肺峰值流速，肺流曲线，肺射血时间（PET）和肺加速时间（PAT）^11，12 （图3B）。按 电影存储 按钮记录数据。
   5. 将换能器进一步移向基底，并使用彩色多普勒观察主动脉血流（图3C）。使用 PW 多普勒可视化血流并测量主动脉射血时间 （AET）。按 电影存储 按钮记录数据。
   6. 使用LVID舒张末期（LVIDd），LVID收缩末期（LVIDs）和AET计算Vcf（circ/sec）¹³，¹⁴，这是心肌性能的指标^，如下所示（表1）:
      （LVIDd - LVIDs） / （LVIDd x AET）
5. 捕获顶端四室视图。
   1. 将平台放置在特伦德伦堡位置，将其向左倾斜，然后调整探头以可视化四个腔室（图 4A）。
   2. 使用彩色多普勒可视化血流，使用二尖瓣瓣口中央二尖瓣瓣叶尖端的PW多普勒来记录二尖瓣血流。按 电影存储 以记录数据。
   3. 在此视图中，计算以下参数²、^3、10（图 4B 和表 1）:
      1. 计算 E/A 比率，即舒张期早期的最大血流速度 （E） 与舒张期晚期的最大血流速度 （A）。
      2. 确定 E 波减速时间 （DT），即从峰值 E 到早期舒张期结束的时间。
      3. 计算左心室等容舒张时间 （IVRT），即从主动脉瓣关闭到二尖瓣打开的时间。
      4. 计算左心室等容收缩时间 （IVCT），即从二尖瓣关闭到主动脉瓣打开的时间。
   4. 在四腔视图中使用二尖瓣环隔侧的组织多普勒测量舒张早期充盈（e'）和舒张期晚期充盈（a'）中的心肌松弛速度峰值，以及收缩期心肌收缩速度峰值（s'）（图4C 和 表1）。按 电影存储 按钮记录数据。
6. 捕获修改后的 PLAX 视图以检查左前降冠状动脉。
   1. 使用修改后的PLAX视图¹⁵，横向移动换能器并将光束向前倾斜（图5A）。
   2. 移动探头并使用彩色多普勒可视化从主动脉产生的左主冠状动脉（LCA）的起源。识别从 LCA 产生并在左心室前壁和右心室流出道之间运行的 LAD 动脉^16，17。在这个位置，应用PW多普勒来测量LAD流量（图5B）。按 电影存储 按钮记录数据。
   3. 计算以下LAD冠状动脉血流参数（图5C 和 表2）:冠状动脉血流峰值速度（CFV），平均CFV和速度-时间积分（VTI）。
      注意:所有这些参数均在1.5%（基线）的基础异氟醚浓度下测量。
   4. 将异氟醚浓度增加至2.5%，等待5分钟以达到最大流量（图5C）。按电影存储按钮记录数据。将CFR计算为最大流量处舒张压峰值CFV与基线¹⁸，^19，20处舒张压峰值CFV的比率（表2）:
      CFR = 舒张压峰值 CFV （2.5%） / 舒张压峰值 CFV （1.5%）

3. 影像后动物监测和护理

1. 完成超声心动图成像后，仔细清洁幼犬并让它从麻醉中恢复约 2 分钟。
2. 在将幼犬送回笼子之前，用笼子妈妈的垫料涂抹幼犬，以防止被拒绝或同类相食。
3. 手术后观察母亲的行为约30分钟。如果观察到攻击性行为，请按照动物程序指南对幼犬实施安乐死。

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结果

这项研究使用7天大的小鼠幼崽来表征心脏形态、功能和冠状动脉血流。鼠标处理需要小心，并且鼠标平台必须适应幼崽的小尺寸，如图 1 所示。PLAX视图的代表性图像如图2A和补充视频1所示。在此视图中，M模式用于测量左心房（LA）直径（图2B）。PSAX视图（补充视频2）用于测量左心室腔尺寸（图3A），肺?...

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讨论

在预防医学时代，需要早期评估心血管功能的改变，以确定疾病的发作并设计适当的介入疗法。小鼠越来越多地被用作心脏研究中的临床前模型，超声心动图研究通常在年轻成年小鼠中进行。然而，为了研究遗传改变或药物干预在心脏病早期阶段的作用，需要在生命的早期开始超声心动图成像。有问题的是，新生小鼠的超声心动图研究在技术上具有挑战性。在这项研究中，我们建立了一个协议，?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Depilating agent	Nair Hair Remover
Electrode gel	Parker Laboratories	15-60
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
Isoflurane	MedVet	RXISO-250
Linear array high frequency transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS550D
Mice breeding pair	Charles River Laboratories	FVB/N	Strain Code 207
Ultrasound Gel	Parker Laboratories	11-08
Vevo Lab Software	FUJIFILM VisualSonics, Inc.		Verison 5.5.1