成像引导的生物反应器，用于生成生物工程气道组织

摘要

该协议描述了一种支持成像的生物反应器，该反应器允许从大鼠气管中选择性地去除内源性上皮，并在管腔表面均匀分布外源细胞，然后对细胞组织构建体进行长期 体外 培养。

摘要

气道组织反复损伤可损害肺功能并引起慢性肺病，如慢性阻塞性肺病。再生医学和生物反应器技术的进步为生产实验室培养的功能性组织和器官结构体提供了机会，这些结构和结构体可用于筛选药物，模拟疾病和工程组织替代物。在这里，描述了一种小型化生物反应器与成像方式相结合，该成像方式允许在体外组织操作和培养期间原位可视化外植大鼠气管的内腔。使用这种生物反应器，该方案展示了成像引导的内源性细胞成分的选择性去除，同时保留了气道组织基质的内在生化特征和超微结构。此外，还显示了外源性细胞在去细胞化气道腔上的递送，均匀分布和随后的延长培养，并进行光学原位监测。结果强调，成像引导的生物反应器可能用于促进功能性体外气道组织的产生。

引言

呼吸道的腔内表面衬有一层上皮，主要由多纤毛，球杆，高脚杯和基底干细胞^1，2组成。上皮层是肺的主要防御机制，充当生物物理屏障，保护下面的气道组织免受吸入病原体，颗粒物或化学气体的侵害。它 通过 多种机制保护气道组织，包括细胞间紧密连接形成，粘膜纤毛清除以及抗菌和抗氧化剂分泌^3，4。气道上皮缺陷与破坏性呼吸系统疾病相关，例如慢性阻塞性肺疾病 （COPD）⁵、原发性睫状肌运动障碍 （PCD）⁶ 和囊性纤维化 （CF）⁷。

肺芯片（LOC）技术的进步代表了研究人类肺部发育，模拟各种肺部疾病以及在严格监管 的体外 环境中开发新治疗材料的机会。例如，气道上皮和内皮可以在薄的多孔膜的相对侧培养，以模拟交换肺组织的气体，从而允许忠实的疾病建模和药物测试⁸。同样，已经创建了 体外 疾病模型来模拟 体外气道疾病，例如COPD⁹ 和囊性纤维化

研究方案

下面的动物组织方案已获得史蒂文斯理工学院动物护理和使用委员会研究所（IACUC）的动物福利指南和法规的批准，并且符合美国国立卫生研究院（NIH）关于使用实验动物的指南。

1. 影像引导大鼠气管生物反应器的设计与搭建

1. 大鼠气管生物反应器的设计与制造
   1. 使用 CAD 生成器软件创建具有相关设计（如入口、出口和组织培养室）的生物反应器腔室的计算机辅助设计 （CAD） 模型。对于本研究，请使用图1A-C中所示的几何形状和尺寸。CAD生成器软件的教程可以在^16，17中找到。
   2. 将生成的CAD模型导出到计算机数控（CNC）控制器软件，并使用CNC机器切割聚四氟乙烯（PTFE）塑料以创建生物反应器室。CNC控制器软件的教程可以在¹⁸中找到。
      注：除聚四氟乙烯外，其他塑料材料，如超高分子量聚乙烯（UHMWPE）和聚醚酰亚胺也可用于制造培养室。
   3. 对所有生物反应器组件（如鲁尔适配器和螺钉）进行灭菌，以避免污染设备中培养的组织和细胞。在清洁的环境中将所有生物反应器组件组装到主组织培养室中（

结果

基于GRIN晶状体 的原位 成像方式可以原 位 显示气管内腔（图5A）。使用这种成像方法，可以获得天然和去上皮化气管的明场和荧光图像（图5B，C）。在CFSE标记之前，没有从天然气管中观察到荧光信号（图5Bii）。然而，当用CFSE染料标记气管上皮时，在整个上皮中观察到均匀的荧光信号（绿色）（

讨论

在这项工作中，我们创建了一种成像引导的生物反应器，可以允许（i）在细胞去除和外源性细胞递送后 原位 监测气管腔，以及（ii）细胞接种气管组织的长期 体外 培养。使用这种定制的生物反应器，我们证明了（i）使用洗涤剂和振动辅助气道洗涤从气管腔中选择性地去除内源性上皮细胞，以及（ii）使用细胞负载的胶原I预凝胶将外源性细胞均匀分布到脱毛气管腔表面上。此外，?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10-010-031
3-port connector	World Precision Instruments	14048-20
4-port connector	World Precision Instruments	14047-10
Accelerometer	STMicroelectronics	IIS3DWBTR
Achromatic doublet	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub	TED PELLA	16111
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062
Assembly rod	Thorlabs	ER1
Button head screws	McMaster-Carr	91255A274
Cage cube	Thorlabs	C4W
Carbon double-sided conductive tape	TED PELLA	16073
CFSE labelling kit	Abcam	ab113853
Citrisolv (clearing agent)	Decon	1061
C-mount adapter	Thorlabs	SM1A9
Collagen I	Advanced BioMatrix	5153
Conductive liquid silver paint	TED PELLA	16034
Dichroic mirror	Semrock	DI03-R488	Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter	Cole-Parmer	EW-45501-30
Female luer to tubing barb	Cole-Parmer	EW-45508-03
Female to male luer connector	Cole-Parmer	ZY-45508-80
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10082147
Filter lens	Chroma Technology Corp	ET535/50m
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse E1000 - D
Fusion 360	Autodesk
Hex nut	McMaster-Carr	91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Fisher Scientifc	AC120585000
Imaging fiber	SELFOC, NSG group	GRIN lens
Laser	Opto Engine	MDL-D-488-150mW
Lens tubes	Thorlabs	SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	L3224
MACH 3 CNC Control Software	Newfangled Solutions
Objective lens	Olympus	UCPLFLN20X
Peristaltic Pump	Cole Parmer	L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic	PeproTech	100-18B
Retaining ring	Thorlabs	SM1RR
Scientific CMOS camera	PCO Panda	PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate	VWR	97064-472
Solidworks (2019)	Dassault Systèmes
Stackable lens tube	Thorlabs	SM1L10
Subwoofer plate amplifier	Dayton Audio	SPA250DSP
Subwoofer speaker	Dayton Audio	RSS21OHO-4	Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump	World Precision Instruments	AL-4000
Threaded cage plate	Thorlabs	CP33
Threaded luer adapter	Cole-Parmer	EW-45513-81
Tube lens	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Tygon Tubing	Cole-Parmer	13-200-110
XY Translator	Thorlabs	CXY1