离体 啮齿动物三叉血管系统中降钙素基因相关肽的释放

摘要

本协议描述了 离体 降钙素基因相关肽（CGRP）释放模型以及量化药理学药物对啮齿动物三叉神经血管系统释放的CGRP量的影响的策略。

摘要

降钙素基因相关肽（CGRP）于1980年代首次被发现，是降钙素基因的剪接变体。自发现以来，它在偏头痛病理生理学中的作用已经得到充分确立，首先是其有效的血管扩张剂特性，随后是其在感觉三叉神经血管系统中作为神经递质的存在和功能。CGRP的偏头痛诱发能力支持制药行业开发抑制CGRP作用的单克隆抗体和拮抗剂。一种新的治疗模式已被证明在偏头痛的预防性治疗中是有效的。进一步了解偏头痛机制的有用工具之一是三叉神经血管系统释放CGRP的 离体 模型。这是一种相对简单的方法，可以与各种药理学工具一起使用，以获得进一步开发新的有效偏头痛治疗方法的专业知识。本协议描述了CGRP释放模型和量化药理学试剂对啮齿动物三叉神经血管系统释放量的CGRP影响的技术。提供了描述从安乐死到蛋白质水平测量的实验方法的程序。详细描述了小鼠和大鼠三叉神经节和三叉神经核尾核的基本分离以及大鼠硬脑膜的制备。此外，还介绍了两个物种（大鼠和小鼠）的代表性结果。该技术是利用各种药理化合物和转基因动物研究偏头痛病理生理学中涉及的分子机制的关键工具。

引言

偏头痛是一种神经系统疾病，据世卫组织称，估计影响10亿多人，是全世界残疾的主要原因之一¹。因此，偏头痛对患者和社会都有重大影响。尽管CGRP拮抗药物最近取得了临床成功，但很大一部分患者需要改进治疗方案²，³，^4，5。需要阐明偏头痛病理生理学，从而找到新的有效治疗方法。由脑膜、三叉神经节 （TG） 和尾部三叉神经核 （TNC） 组成的三叉神经血管系统内的信号传导是偏头痛病理生理学的核心^6，7。

37 个氨基酸的神经肽降钙素基因相关肽 （CGRP） 于 1980 年代初首次被发现，当时 Amara 及其同事证明，降钙素基因的主要 RNA 转录本可以被加工以提供除降钙素^8，9 之外的 CGRP 的 mRNA 编码。随后的研究表明与偏头痛病理生理学有关¹⁰。CGRP是一种具有强效血管舒张特性的神经递质¹¹，12，13，14，15，16，¹⁷，广泛分布于中枢和周围神经系统¹³，¹⁴，^18，19，^20，21，22.在人类偏头痛发作期间，发现脑外循环中的CGRP水平升高²³，并且输注CGRP会导致患者偏头痛样疼痛²⁴，从而强调了CGRP在偏头痛中的参与。两年后，关于CGRP拮抗剂olcegepant治疗偏头痛有效性的首次概念验证研究发表²⁵。

CGRP在三叉神经血管系统中含量丰富，如TG²¹，²⁶、支配硬脑膜的感觉神经纤维²⁷，^28，29和TNC³⁰所示。在三叉神经血管系统中，CGRP存在于TG的中小型神经元中，在无髓鞘的C纤维中，并且在TG的近50%的神经元群中表达。CGRP受体主要在较大的神经元中表达，并在髓鞘化的Aδ纤维^31，32中发现。CGRP在化学或电刺激下从神经元释放^33，34。研究导致CGRP释放的途径和这种激活的位置对于理解偏头痛病理生理学至关重要。在过去的50年中，临床前研究有助于获得有关偏头痛相关信号的广泛知识，并有助于开发新的治疗方法³⁵。许多考虑血管和神经源性受累的方法已被修改并应用于偏头痛研究。可以提及动脉对生物化合物或药物治疗的反应的体内和体外模型17，³⁶，³⁷和电神经刺激^38，39。此外，TNC中激活的神经元可以通过c-Fos表达^40，41，⁴²和该区域的电生理记录^43，44来检测。这两种方法都测量从头部传递到大脑的伤害性信号，例如硬脑膜。仅使用一种临床前模型并不能呈现偏头痛病理生理学的全貌。因此，结合涵盖偏头痛病理生理学尽可能多的方面的不同模型非常重要。新模型的持续开发将涵盖偏头痛机制的各个方面，并及时揭开偏头痛病理生理学的奥秘。

在这里，介绍了CGRP释放方法的详细方案，该方法在化学刺激后从小鼠中分离出TG和TNC离 体进行 。CGRP释放也可以在大鼠的硬脑膜中研究。因此，在大鼠的实验方案中，硬脑膜与TG和TNC一起描述。CGRP释放方法的基础于1999年首次描述，Ebersberger及其同事进行了开创性研究，发现CGRP在化学和电刺激大鼠⁴⁵的硬脑膜传入后从硬脑膜中释放出来。后来，这种方法扩展到TG⁴⁶ 和TNC⁴⁷的CGRP版本。随后，对该方法进行修改以应用于小鼠的TG和TNC。到目前为止，从硬脑膜释放CGRP在小鼠中一直具有挑战性。

研究方案

所有动物护理和实验程序均按照欧洲共同体动物护理和使用指南（2010/63/UE）进行。使用10周龄的雄性C57BL / 6JBomTac小鼠和10周的雄性Sprague Dawley大鼠来证明该协议。

1. 合成组织液的制备

1. 根据以下配方制备合成组织液（SIF）：108 mM NaCl，3.48 mM KCl，3.50 mM MgSO 4，26 mM NaHCO₃，11.70 mM NaH 2 PO₄，1.50 mM CaCl₂，9.60 mM 葡萄糖酸钠，5.50 mM 葡萄糖和 7.60 mM 蔗糖（见材料表）。
   注意：SIF可以根据刺激目标而变化，例如，在研究钙通道时可以使用无钙溶液。
2. 将pH调节至7.4，并通过碳原气体（5%CO₂ 和95%O₂）稳定^pH46。

2. 安乐死

1. 用70%CO₂ 和30%O₂的混合物麻醉成年小鼠和大鼠。用一把剪刀斩首老鼠，用断头台斩首老鼠（见 材料表）。
   注意：使用符合研究目的的菌株和年龄。男性和女性都可以在此模型中使用。
2. 在脊髓的C3-C4水平将头部与身体分开。
   注意：安乐死也可以通过腹腔注射戊巴比妥（100-150 mg / kg）进行。

3. 解剖

1. 按照以下步骤准备大鼠组织。
   1. 用一把剪刀去除头部和颈部周围的皮肤和肌肉（图1A）。
   2. 使用骨头修剪器和剪刀将下颌与头部分开（图1B-C）。
   3. 通过将骨修剪器尾部插入椎骨的背侧来打开脊髓，并去除椎骨的背侧部分以露出脊髓和脑干（图1D）。
   4. 通过枕骨和顶骨的边界切割颅骨的尾部，以去除暴露小脑的这些骨结构（图1E）。
      注意：重要的是在切割和切除椎骨时不要损坏脑干和脊髓。
   5. 用弹簧剪刀切割脑干的背外侧部分，隔离每侧距前膛约 13-16 毫米尾部的 TNC （Sp5C）。将左侧和右侧TNC浸入SIF中（图1E-I）。
      注意：描述对应于成年大鼠。
   6. 将头部矢状切中，用锯将颅骨一分为二（图1J-L）。
   7. 小心地取出大脑，不要使用刮刀接触附着在颅骨上的硬脑膜，并切断进入脑干的三叉神经（图1M-P）。
   8. 要隔离TG，请将其切割，包括其围绕视觉边界的分支。切下颌分支，进入卵圆孔。切开进入颅骨的眼科和上颌分支，因为它们没有在宏观上分开。在解剖TG时，去除覆盖TG的硬脑膜（图1Q-T）。
   9. 将颅骨和TG浸入SIF中。
2. 按照以下步骤准备小鼠组织。
   1. 用小剪刀去除头部和颈部周围的皮肤和肌肉（图2A-B）。
   2. 通过将一把小剪刀尾部插入椎骨的背侧部分来打开脊髓，并取出椎骨的背侧部分以露出脊髓和脑干（图2C）。
      注意：重要的是在切割和移除椎骨时不要损坏脊髓。
   3. 通过枕骨和顶骨的边界切割颅骨，以去除暴露小脑的这些骨结构（图 2D-F）。
   4. 然后，矢状中间切开顶骨并取出骨头以露出大脑（图2G-I）。
   5. 用刮刀小心地取出小脑以暴露脑干（图2J）。
   6. 使用弹簧剪刀分离脑干的含TNC部分（图2K-N）。将TNC浸入SIF中的脑干（图2O）。
   7. 取出大脑并切断进入脑干的三叉神经（图2P-Q）。
   8. 要隔离TG，请将其切割，包括其围绕视觉边界的分支。切下颌分支，进入卵圆孔。切开进入颅骨的眼科和上颌分支，因为它们没有在宏观上分开。在解剖TG时，去除覆盖TG的硬脑膜（图2R-S）。
   9. 将TG浸入SIF中（图2T）。

4. 洗涤

1. 在SIF中清洗头骨两半，TNC和TG30分钟，同时在室温下每5分钟更换一次SIF。
   注意：洗涤步骤可以在将组织保存在带有薄纱盖的塑料容器中的同时进行，以便轻松更换 SIF（图 3A-B）。
2. 按照以下步骤准备大鼠组织。
   1. 将TNC的两半转移到装有350μLSIF的微量离心管盖中（图3C）。
   2. 将TG转移到微量离心管盖上 - 每个微量离心管帽一个TG，含350μLSIF（图3C）。
   3. 将头骨的两半放在由粘土或 6 孔培养板制成的平台上，并用 400 μL SIF 填充颅骨（图 3C）。
3. 按照以下步骤准备小鼠组织。
   1. 用TNC将脑干转移到装有250μLSIF的微量离心管帽中（图3D）。
   2. 将两个TG转移到装有250μLSIF的微量离心管帽中（图3D）。
      注意：使用小鼠组织时，每个微量离心管盖放置两个TG。
4. 将大鼠头骨和带有大鼠和小鼠组织的微量离心管帽置于37°C的加湿培养箱中。 每5分钟使用移液器更换SIF，持续20分钟。
   注意：添加和去除 SIF 时不要接触组织，这一点很重要。

5. 药物检测

1. 确定基础 CGRP 释放级别。
   1. 最后一次洗涤后，向小鼠TG和TNC中加入250μL SIF。向大鼠TG和TNC中加入350μL，向每只大鼠头骨中加入400μL。
   2. 孵育 10 分钟后，在微量离心管中收集 200 μL 样品，并加入 50 μL 10x EIA 缓冲液（随 CGRP 酶免疫测定试剂盒一起提供，参见 材料表）以允许测量基础 CGRP 释放（步骤 6）。丢弃剩余的液体。
      注意：所有样品的孵育时间必须相同。
   3. 立即将样品储存在-20°C。
   4. 在对基础CGRP释放水平进行采样后，遵循以下三种方法之一：（A）单次刺激（步骤5.2）;（B） 浓度反应刺激（步骤5.3）;（C）抑制刺激（步骤5.4）（图4）。
      注意：使用的测试化合物和浓度取决于研究的目的。
2. 按照以下步骤进行单次刺激。
   1. 将测试化合物或载体添加到组织中并放置10分钟（体积：小鼠TG和TNC为250μL，大鼠TG和TNC为350μL，每个大鼠头骨为400μL）。
   2. 孵育 10 分钟后，在装有 50 μL 10x EIA 缓冲液的微量离心管中收集 200 μL 样品。丢弃剩余的液体并立即将样品储存在-20°C。
      注意：所有样品的孵育时间必须相同。
3. 按照以下步骤进行浓度反应刺激。
   1. 将测试化合物或载体稀释至所需浓度。从最低浓度开始，以递增的浓度加入测试化合物。
      注意：使用的测试化合物和浓度取决于研究的目的。例如，本研究使用1 μM、10 μM和100 μM超肉桂醛。
   2. 将测试化合物和相应载体的最低浓度（本研究为1μM）加入两个相同的组织制剂中，孵育10分钟（体积：小鼠组织250μL，大鼠TG和TNC为350μL，每个大鼠头骨为400μL）。
   3. 孵育 10 分钟后，在装有 50 μL 10x EIA 缓冲液的微量离心管中收集 200 μL 样品。
   4. 丢弃剩余的液体，并将第二低浓度（本研究为10μM）添加到组织中。
   5. 立即将样品储存在-20°C。
   6. 用剩余的浓度（本研究为100μM）重复此过程。
4. 按照以下步骤执行刺激抑制。
   1. 将阻断剂或载体添加到组织中并孵育10分钟（体积：小鼠组织250μL，大鼠TG和TNC为350μL，每个大鼠头骨为400μL）。
      注意：使用的阻滞剂和浓度取决于研究的目的。例如， 图5中的代表性结果使用3 μM格列本脲。
   2. 孵育 10 分钟后，在装有 50 μL 10x EIA 缓冲液的微量离心管中收集 200 μL 样品。丢弃剩余的液体并立即将样品储存在-20°C。
   3. 将激动剂或激动剂+阻断剂（见 材料表）加入组织中并孵育10分钟。
      注意：使用的激动剂，阻断剂和浓度取决于研究的目的。在本研究中，使用了3μM格列本脲和1μM辣椒素， 图5。
   4. 孵育 10 分钟后，在装有 50 μL 10x EIA 缓冲液的微量离心管中收集 200 μL 样品。丢弃剩余的液体并立即将样品储存在-20°C。
5. 对实验进行阳性对照。
   1. 适当时，在方案结束时向组织添加阳性对照（例如，1-10μM辣椒素，参见 材料表），并在孵育10分钟后，在微量离心管中收集200μL样品，其中含有50μL 10x EIA缓冲液。
      注意：包括阳性对照以确保设置和组织正常工作是有利的。辣椒素 48，^49，50 或钾的去极化刺激（40-60 mM 的 KCl）⁴⁶，^47，49 通常用于引起三叉神经血管系统释放 CGRP。制备40-60 mM的KCl SIF作为SIF，除了NaCl在等摩尔基础上交换为KCl。

6. CGRP浓度分析

1. 按照制造商的方案，使用酶免疫测定（EIA）试剂盒测量CGRP的释放量（参见 材料表）。
2. 使用板式光度计测量410nm处的光密度。如果使用不同的CGRP EIA试剂盒，请测量制造商协议中提供的波长处的光密度。
   注意：样品必须稀释以匹配标准曲线。
3. 执行数据分析。
   1. 将数据显示为绝对浓度或归一化为特定组织的基础CGRP释放。

结果

该技术是研究偏头痛中CGRP相关分子机制的工具。它具有评估三叉神经血管系统不同水平的CGRP释放的优点，并且可以与各种药理化合物组合应用于野生型和转基因小鼠和大鼠。在这里，介绍了大鼠的浓度反应和阻断实验以及野生型和转基因小鼠的浓度反应结果。

采用CGRP释放法研究K_ATP通道抑制剂格列本脲对雌性自发性三叉神经异常女性（STA）大鼠TG和硬脑膜CGRP释放的影响。首先，使用浓度反应研究设计找到了辣椒素的最佳浓度。与载体相比，辣椒素暴露诱导硬脑膜和TG释放显着的CGRP（图5）。在硬脑膜中，在1μM辣椒素处发现CGRP的最大释放量，而在TG中，在10μM辣椒素处发现最大CGRP释放量（图5A-B）。基于浓度反应实验，使用1 μM辣椒素和3 μM格列本脲进行封闭实验。当用单因素方差分析⁵¹分析时，格列本脲对硬脑膜基础CGRP释放（P = 0.441）和TG（P = 0.881）没有影响。当用单因素方差分析（图5C-D）51时，与辣椒素相比，格列本脲显着降低了硬脑膜中辣椒素诱导的CGRP释放40%（P = 0.031）和TG39%（P = 0.003）。

在小鼠中，该方案用于检查瞬时受体电位ankyrin 1（TRPA1）离子通道在偏头痛GTN小鼠模型中的参与，其中GTN诱导的超敏反应完全依赖于TRPA1通道。发现TRPA1激动剂超肉桂醛（SCA）以剂量依赖性方式从TG中释放CGRP，与1μM，10μM和100μM的SCA相比，当使用双向方差分析时，与载体相比，CGRP的释放量分别增加了9%（P = 0.23），51%（P = 0.011）和69%（P = 0.0097）。在Trpa1空小鼠的TG中不存在这种释放，其中暴露于1μM，10μM和100μM的SCA导致CGRP释放的11%（P > 0.99），-13%（P > 0.99）和9%（P = 0.97）与载体相比，当用双向方差分析时。随后用10μM辣椒素（阳性对照）刺激表明所有组织样品都可以释放CGRP（图6）⁵⁰。

图1：逐步解剖大鼠的组织。 （A-T）详细信息在协议部分（步骤3.1）中提供。 请点击此处查看此图的大图。

图2：逐步解剖小鼠组织。 （A-T）详细信息在协议部分（步骤3.2）中提供。 请点击此处查看此图的大图。

图3：啮齿动物组织的洗涤和孵育。 （A-B）新鲜分离的组织在带有SIF的塑料容器中。容器上覆盖有薄纱，便于更换 SIF。（C） 大鼠组织 - 两半颅骨，硬脑膜覆盖颅骨内壁，放置在 6 孔培养板上。左右三叉神经核尾部在单独的微量离心管盖（顶排盖）中。两个三叉神经节在单独的微量离心管盖（盖底排）中。（D）小鼠组织 - 将含有脑干的三叉神经核尾部部分放在单独的微量离心管盖（顶部）中。两个小鼠三叉神经节在一个微量离心管盖（底部）中。请点击此处查看此图的大图。

图 4：CGRP 发布的研究设计。 用于执行 CGRP 释放实验的三种不同协议。药物应在合成组织液（SIF）中稀释。（一）单次刺激。（B）浓度反应刺激。（C）抑制刺激。 请点击此处查看此图的大图。

图 5：格列本脲抑制辣椒素诱导的大鼠硬脑膜和三叉神经节释放 CGRP。使用商业人CGRP EIA试剂盒测量了来自雌性自发性三叉神经异常（STA）大鼠（215-318 g）分离的三叉神经节和硬脑膜的CGRP水平⁵²。（A-B）在增加辣椒素（10nM，100nM，1μM和10μM）浓度后，CGRP从（A）硬脑膜和（B）三叉神经节释放（n = 4）。数据以单个点表示，并使用双向方差分析进行分析。p <暴露于载体10分钟后，从（C）硬脑膜和（D）三叉神经节释放的CGRP水平为0.0001（C-D），3μM格列本脲（glib），1μM辣椒素和1μM辣椒素+ 3μMglib（n = 6-11）。数据以单个点和平均值表示，并使用单因子方差分析进行分析。*与车辆相比。^#辣椒素与辣椒素+glib的比较。^#P < 0.05， ** 和 #^#P < 0.01， ****P < 0.0001。分析之后是邦弗朗尼的多重比较测试。所有测试均使用显着水平α = 0.05。这个数字是从克里斯滕森等人修改而来的。⁵¹. 请按此查看本图的大图。

图 6：SCA 暴露导致小鼠三叉神经节释放 TRPA1 依赖性 CGRP。在暴露于1μM，10μM和100μM的超肉桂醛（SCA）和10μM的辣椒素作为阳性对照（n = 6）后，用大鼠CGRP EIA试剂盒测量从WT和Trpa1 null（Trpa1tm1 / Dpc）⁵³雄性小鼠（8-10周）分离的三叉神经节释放的CGRP水平。来自每个鼠标的数据显示为单独的点，条形表示平均值。统计：使用双向重复方差分析进行每种浓度的SCA和载体之间以及基础对照和阳性对照之间的比较。显著水平 α = 0.05。*P < 0.05，**P < 0.01。这个数字是从克里斯滕森等人修改而来的。⁵⁰. 请按此查看此图的大图。

讨论

所描述的方法是在研究表明CGRP在偏头痛病理生理学中的重要性之后开发的。它非常适合研究三叉神经血管系统释放CGRP的机制，这对于头部区域的疼痛信号传导至关重要。在该模型中获得的CGRP量直接测量支配硬脑膜，TG和TNC的三叉神经释放的CGRP量。CGRP的释放量定量大于人类热凝后血浆中测得的释放量45，⁵⁴，猫³⁹，^55，56和偏头痛发作期间²³。一种解释可能是CGRP在血液中被稀释和降解⁵⁴。然而，需要注意的是，用化学物质直接刺激可能优于病理生理激活。进一步的优点是，可以从三叉神经血管系统内的三个不同部位定位释放，并且可以与药理学操作和转基因啮齿动物的组织一起使用。

最近，许多临床前啮齿动物模型专注于全身施用物质和随后的疼痛或偏头痛相关读数，使用von Frey测试^57，58，鬼脸⁵⁹，^60，61或光厌恶62，^63，64。这些方法有助于了解不同物质的疼痛诱导和缓解疼痛的特性。然而，这些方法没有提供关于所涉及的特定靶组织的信息。在本方法中，三叉神经血管系统分为三种结构：硬脑膜，TG和TNC。这样可以对每个结构进行局部暴露，并评估特定物质的作用位置。这在2011年的一项研究中得到了利用，其中探索了电压门控钙通道在大鼠中的作用，发现这些通道的抑制在三叉神经血管通路的三种结构中是不同的⁴⁷。在解剖神经系统结构时，轴切开术是不可避免的。轴切开术已被证明可以改变各种基因的转录⁶⁵。这些转录变化太慢，无法影响该方法的结果，但与体内情况相比，不能排除磷酸化的变化⁴⁶。虽然CGRP等神经肽在细胞体中形成，但神经肽的释放和作用通常在中枢或周围神经末梢。因此，在研究神经肽释放时，对完整神经元（包括末端）的研究很有趣。因此，已经建立了研究来自孤立神经节的神经元培养物的方法，以作为终端的模型。然而，神经元细胞培养物存在几个问题，因为机械解离会破坏培养物中的神经元⁴⁶。与细胞培养相关的较长时间框架使该方法对由于轴切开术和培养条件引起的转录组变化敏感⁶⁵。此外，生长因子的添加和表面涂层上的培养改变了神经元作为递质和受体表达⁶⁶，^67，68，69的性质。在研究新鲜分离的完整神经节而不是神经元细胞培养物时，可以避免这些问题。

离体CGRP释放方法的一个挑战是精确解剖可重复结果所需的组织。特别准确地解剖TNC具有挑战性，因为这是脑干内没有可见边界的结构。此外，硬脑膜很脆弱，需要仔细去除大脑以确保结构完整。这些障碍可导致不同的组织大小，从而改变基础和刺激诱导的CGRP水平。然而，这种变化可以通过归一化到基础CGRP释放来解释。还应该注意的是，当从小鼠中分离TNC时，脑干的整个下部被分离出来，而不是像在大鼠中那样更具体的含TNC的部分。一般来说，使用大鼠组织可能是一个优势，因为这允许测量硬脑膜释放的CGRP和更精确地解剖TNC。此外，组织的大小也允许使用大鼠作为其载体对照，因为一只大鼠产生两个半颅骨，两个TG和两个TNC，其中一块组织用于物质刺激，另一块用于载体。当使用小鼠时，一个实验需要两只动物，因为两个TG都汇集在一个样品中，并且TNCs被解剖为一个脑干。因此，两个TG和一个脑干用于物质刺激，两个TG和一个来自另一只小鼠的脑干用于载体控制。这导致使用两倍于大鼠的小鼠来获得相同数量的重复。为了减少使用的小鼠数量，已经提出了一种测量脑干切片中CGRP释放的方法⁴⁹。一个优点是该方法已被修改以能够使用小鼠。这允许使用许多已经可用的转基因小鼠品系，这是研究信号通路等的有用工具。实验结束时应包括阳性对照，以确保实验中使用的组织可以释放CGRP。阳性对照可能是TRPV1激动剂辣椒素或去极化刺激钾（KCl），已发现它们在小鼠和大鼠^46，47，48，^49，50中从三叉神经血管系统中释放CGRP。此外，该方法还适用于测量其他相关肽作为垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）的释放 - 偏头痛研究中非常感兴趣的另一种肽⁷⁰。

该方法为研究大鼠和小鼠特定靶组织中CGRP的释放提供了有用的工具。这是一种相对快速的方法，可以避免与培养神经元相关的问题。该方法方案可以很容易地修改，以研究浓度-反应关系或各种药理化合物对反应的抑制。 离体 CGRP释放法是几种临床前方法之一，可用于研究CGRP的作用以及与CGRP释放相关的其他机制在偏头痛病理生理学中的作用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture plate	NUNC	140675
Calcium chloride dihydrate	Merck	1.02382.1000	For SIF buffer
Caps for plastic containers	ThermoFisher Scientific	536617
Capsaicin	Merck	M2028
CGRP kits	AH Diagnostics	A05482.96
CO2	Strandmøllen	4.6	For carbogen gassing of SIF
Delicate Bone Trimmer	Fine Science Tools	16109-14
Glibenclamide	Tocris	911
Glucose	Merck	G7021	For SIF buffer
Guillotine for rats	Scandidact	NS-802
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	M5921	For SIF buffer
Microcenrifuge tubes + lids/caps	VWR	700-5239
Mini Hacksaw	BAHCO	208
O2	Strandmøllen	4.5	For carbogen gassing of SIF
Pentobarbital	Glostrup pharmacy	NA	Magistral formula
Plastic containers	ThermoFisher Scientific	536455
Plate photometer - Infinite M200	Tecan	NA	Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan. Software: SW Magellan v.6.3
Potassium chloride	Merck	P9333	For SIF buffer
Scissor	Allgaier Instruments	307-156-170
Small scissor	Allgaier Instruments	04-520-115
Sodium bicarbonate	Merck	S6014	For SIF buffer
Sodium chloride	Merck	S9888	For SIF buffer
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	1.06346.1000	For SIF buffer
Sodium gluconate	Merck	S2054	For SIF buffer
Spatula	Bochem Lab Supply	3018
Spring scissor	Fine Science Tools	15024-10
Sucrose	Merck	84097	For SIF buffer
Supercinnamaldehyde	Merck	S3322
Tulle (fabrics)	NA	NA	Bought in the local fabrics store