体内 小鼠视网膜血管损伤读数以促进可重复性

摘要

在这里，我们提出了三种用于荧光素血管造影（FA）和光学相干断层扫描（OCT）图像的数据分析协议，用于视网膜静脉遮挡（RVO）的研究。

摘要

眼科成像工具的进步为研究神经血管损伤动物模型的研究人员提供了前所未有的访问水平。为了正确利用这种更大的可翻译性，需要设计可重复的方法，从这些图像中提取定量数据。光学相干断层扫描 （OCT） 成像可以在微米分辨率下解析视网膜组织学，并揭示血管血流的功能差异。在这里，我们描绘了无创血管读数，用于在优化的视网膜静脉阻塞（RVO）小鼠模型中表征血管损伤后的病理损伤。这些读数包括视网膜形态的实时成像分析、毛细血管缺血的视网膜内层紊乱 （DRIL） 测量以及视网膜水肿和血管密度的荧光素血管造影测量。这些技术直接对应于临床上用于检查视网膜疾病患者的技术。标准化这些方法可以直接和可重复地比较动物模型与眼科疾病的临床表型，从而提高血管损伤模型的转化能力。

引言

神经血管疾病是导致缺血性中风的主要医疗保健问题，缺血性中风是导致死亡和发病的主要原因，以及导致视力丧失的视网膜血管疾病^1，2。为了模拟神经血管疾病，我们采用了视网膜静脉阻塞（RVO）的小鼠模型。该模型是非侵入性的，利用与临床环境中用于检查视网膜血管疾病患者的体内成像技术类似的 体内 成像技术。因此，该模型的使用增加了使用该模型的研究的转化潜力。与所有小鼠模型一样，最大限度地提高模型的可重复性至关重要。

视网膜血管疾病是70岁以下人群视力丧失的主要原因。RVO是仅次于糖尿病视网膜病变^的第二常见的视网膜血管疾病3。RVO 的临床特征包括缺血性损伤、视网膜水肿和神经元丢失导致的视力丧失^3，4。已经开发和改进了使用激光光凝主要血管的RVO小鼠模型，以复制在人类RVO^5，6，7中观察到的关键临床病理。眼科成像的进步也允许复制用于人类的无创诊断工具，即荧光素血管造影（FA）和光学相干断层扫描（OCT）⁶。荧光素血管造影允许使用注射荧光素（一种小荧光染料8^，9）来观察由于血液 - 视网膜屏障（BRB）的破坏以及视网膜中的血流动力学（包括闭塞部位）引起的泄漏。OCT成像允许获取视网膜的高分辨率横截面图像并研究视网膜层的厚度和组织¹⁰。对FA图像的分析历来主要是定性的，这限制了研究之间直接和可重复比较的潜力。最近，已经开发了许多用于量化OCT成像中层厚度的方法，尽管目前还没有标准化的分析协议，并且OCT图像采集的地点各不相同¹¹。为了正确利用这些工具，需要标准化、定量和可复制的数据分析方法。在本文中，我们提出了三种这样的血管读数，用于评估RVO-荧光素渗漏，OCT层厚度和视网膜层紊乱的小鼠模型中的病理损伤。

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研究方案

该协议遵循视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿动物实验由哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准和监测。

注意:对重约23g的2个月大的C57BL / 6J雄性小鼠进行成像。

1. 视网膜成像试剂的制备

1. 注射荧光素溶液的制备。
   注意:荧光素对光非常敏感。避光，准备后不久使用。
   1. 在无菌盐水中将荧光素稀释至1%的浓度。
2. 氯胺酮/甲苯噻嗪的制备
   1. 在无菌盐水中相应地稀释氯胺酮和赛拉嗪，浓度如下:氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（5-10mg / kg）。
3. 无菌生理盐水
   1. 用带有无菌盐水的26 G针头准备5 mL注射器。

2. OCT和荧光素成像

1. 打开视网膜成像显微镜灯箱、OCT 机和加热鼠标平台。
2. 打开计算机并打开映像程序。
3. 每只眼睛加入一滴去氧肾上腺素和托品卡胺。
4. 腹腔注射150μL麻醉剂（氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（5-10mg / kg））。通过捏住脚趾确定麻醉深度，并等待动物无反应。在双眼上涂抹眼药膏或人工泪液。
5. 将鼠标放在平台上。
6. 调整平台的高度和角度，直到视网膜眼底的视图清晰且聚焦。拍一张眼底的照片。
7. 打开映像和 OCT 软件。在 OCT 程序中，将微移调整为 5。
8. 在距离烧伤远端75μm处拍摄OCT图像。对视网膜的其他三个象限重复此操作。
9. 注入 100 μL 1% 荧光素 IP。
10. 将相机切换到 488 nm 滤光片。将相机增益增加到 5。
11. 在荧光素注射后正好5分钟拍摄眼底照片。
    注意:避免在最大设置下将眼睛长时间暴露在相机光线下，因为荧光素会加剧视网膜光损伤。保持光源关闭，直到 5 分钟等待时间过去并且鼠标准备好成像。

3. 善后

1. 注入 1 mL 无菌盐水 IP。将润滑剂滴眼液涂抹在双眼上。在双眼上涂抹眼药膏或人工泪液。
2. 观察小鼠从麻醉中恢复的过程。只有在完全恢复后，通常在大约40分钟后，才与其他动物一起返回笼子。

4. 排除标准的评估

1. 打开术后24小时拍摄的眼底图像以评估排除标准。如果确定以下任何标准，则排除眼睛。
2. 评估图像是否具有零遮挡
   1. 评估图像中阻塞血管的数量。
      注意:成功的闭塞通常在烧伤处或周围有一些紫色色素沉着，烧伤处的血管非常薄或不连续，烧伤区域外的血管外观微弱或不存在，以及缺氧引起的视网膜变色。如果可以通过激光的白色烧伤看到整个血管，则容器未能遮挡。有时血管会显得部分阻塞，但如果它在烧伤外看起来没有中断，血管可能没有阻塞。
   2. 对于不明确的病例，在同一时间点使用 FA 成像来评估闭塞。在这些图像中，遮挡将表现为血管连续性的中断，通常伴随着周围血管的逐渐变细。
   3. 如果发现零遮挡，则从分析中排除眼睛，因为 RVO 被认为无效。
      注意:闭塞通常在RVO后48-72小时消退，在这些时间点，闭塞的存在不应再用作排除标准。
3. 评估眼底和OCT图像是否有过度视网膜脱离
   注意:诱导RVO后视网膜下积液很常见，并导致神经视网膜与RPE分离。过度视网膜脱离的排除标准定义如下:OCT要么完全不可见，要么某些层看起来非常扭曲。图像质量差，外层丛状和RPE层的分辨率下降。神经视网膜和脉络膜之间的距离大于OCT视野允许的。在眼底图像上，视网膜色调几乎完全是白色的，有一些紫色斑点。部分视网膜可能出现扭曲和失焦。这是因为它已经脱离并且与视网膜其余部分的焦距不同。
   1. 如果对眼睛图像的评估确定视网膜的周边或完全脱离，请将眼睛排除在分析之外。
4. 排除有角膜白内障证据的图像
   注意:角膜白内障在小鼠角膜上显示为不透明的白点。白内障通常是由于动物麻醉时眼睛润滑不足而发生的，通过注意大量涂抹眼膏可以在很大程度上避免白内障。白内障通常可以在成像前通过检查动物来识别。发生白内障的小鼠应从数据集中排除，而无需进行成像过程。在成像中，白内障会遮挡相机的视网膜，OCT会显得翘曲。
5. 评估图像是否出血过多
   注意:过度出血可以识别为图像中的红色液体量，通常模糊视网膜背景，血管和烧伤。这些红色液体区域将比成功 RVO 中正常的紫色斑点更亮、更不透明的红色。出血在OCT成像中出现在神经节细胞层，并干扰了在出血下方观察其他视网膜层的能力。
   1. 如果确定图像出血过多，请从分析中排除眼睛。

5. 荧光素图像处理

1. 在图像处理软件中打开荧光素图像。
2. 复制图像
3. 使用选择工具，仔细追踪主要船只。
   1. 主要血管是从视盘辐射出去的较厚的静脉和动脉。忽略从这些船只分支出来的任何船只。
   2. 如果泄漏阻止在闭塞部位附近看到容器的轮廓，请在容器的大致位置追踪泄漏（保持厚度，将最后一个可见点连接到下一个可见点）。
4. 在第一个图像中，删除所选内容，仅保留背景。保存此蒙版图像。
5. 将选区移动到第二个图像，反转选区并删除，隔离容器。保存此蒙版图像。
6. 在 ImageJ 中打开两个图像。打开背景图像并测量积分密度。
7. 打开容器的图像，选择容器的轮廓，然后测量平均强度。
8. 将背景的积分密度除以血管的平均强度，生成眼睛的泄漏率。
9. 记录实验队列中每只眼睛的泄漏率。
10. 为了进一步控制背景，将实验眼睛归一化为未受伤对照眼睛的平均渗漏率。
    注意:为了创建FA图像中荧光素泄漏的标准化定量，此计算使用背景密度（将存在泄漏的地方）与主要血管亮度的比率来创建控制图像之间亮度变化的结果，并且可以可靠地量化。未受损的眼睛没有渗漏，理论上的比率应为零。因此，从这些未受损的对照眼计算的比率代表背景噪声，该值用于进一步归一化实验值。

6. 视网膜层厚度

1. 在图像处理软件中打开OCT图像。
2. 追踪神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、感光器层和 RPE 层的边界。测量每层的平均厚度。
3. 对视网膜其他三个象限的OCT图像重复此操作。平均四个象限的平均层厚度，以获得眼睛每个视网膜层的平均厚度。
4. 对实验队列中的每只眼睛重复此操作。

7. 视网膜内层紊乱

1. 在 ImageJ 中打开 OCT 映像。
2. 使用线工具测量外层丛状层上边界不明显的距离。
   注意:区分DRIL和由成像伪影引起的层可见性差的区域非常重要。如果没有足够的图像分辨率，较差的OCT图像质量可能会使眼睛无法进行DRIL分析。带有DRIL的图像通常具有清晰解析和组织的其他区域或视网膜层，这可以很好地指示足够的图像质量。
   1. 水平测量从杂乱开始的纬度到外丛状层的上边界再次可见的纬度（如果有的话）。即使外部丛状层垂直向上或向下移动，也可以完美地水平测量。
   2. 可能有多个无组织区域被没有混乱的区域隔开。单独测量这些并计算距离的总和。
3. 将混乱的长度除以每个OCT图像中可见的视网膜的总长度，以获得图像的混乱比率。
4. 对视网膜其他三个象限的OCT图像重复测量和计算。
5. 取四个OCT图像的混乱比率的平均值。这个数字代表整个视网膜的平均混乱。对实验队列中的每只眼睛重复此操作。

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结果

这些分析方法允许量化FA和OCT成像捕获的视网膜病理。从中提取代表性数据的实验使用C57BL / 6J雄性小鼠，这些小鼠作为未受伤的对照或接受RVO程序并接受Pen1-XBir3治疗眼药水或Pen1-Saline载体滴眼液。RVO损伤模型涉及在尾静脉注射孟加拉玫瑰（一种光活化剂染料12）后，对麻醉小鼠每只眼睛的主要静脉进行激光照射（⁵³² nm）。在距视神经中枢平均375μm的距离处传递三个激光脉冲以诱?...

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讨论

无创啮齿动物视网膜成像为研究病理学和开发干预措施提供了途径。以前的研究已经开发并优化了RVO的小鼠模型，限制了变异性并允许对小鼠视网膜中常见临床病理的可靠翻译5，^7，13。眼科成像技术的发展进一步允许在实验动物中使用临床体内成像技术，如FA和OCT，从而能够将小鼠模型与^{人类疾病特征}...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AK-Fluor 10%	Akorn	NDC: 17478-253-10	light-sensitive
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
GenTeal	Alcon	00658 06401
Image J	NIH
InSight 2D	Phoenix Technology Group		OCT analysis software
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoenix Micron IV	Phoenix Technology Group		Retinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian Module	Phoenix Technology Group		Laser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module	Phoenix Technology Group		OCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix Module	Phoenix Technology Group		Fundus imaging and acquisition targeting
Photoshop	Adobe
Refresh	Allergan	94170
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20