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Method Article
在这个视频文章中,我们描述了一种新的方法,让嗅觉梯度与稳定,可控的几何图形的建设。我们简要地说明这些梯度如何可用于嗅觉缺陷(完全和部分嗅觉丧失)屏幕和趋化行为的研究更微妙的功能。
传统上一直在果蝇幼虫的嗅觉反应研究中的Petri菜组成一个单一的外设气味源。在这种行为范式,实验者通常假定的气味分子,从源头上迅速扩散,导致创造一个稳定的菜梯度。要建立一个感觉输入和行为反应之间的定量关系,这是必要的气味刺激条件下实现更彻底的表征。在这个视频文章中,我们描述了一种新的方法,让嗅觉梯度与稳定,可控的几何图形的建设。我们简要地说明这些梯度如何可用于嗅觉缺陷(完全和部分嗅觉丧失)屏幕和趋化行为的研究更微妙的功能。
1。设备和试剂
气味稀释:
含量舞台设置:
制备果蝇幼虫的行为测试:
记录幼虫的议案:
2。行为的舞台
行为上由三个叠96孔培养皿盖子。底部的盖子是用来隔离系统的其余部分从光垫,并减少在赛场上的对流。第二个盖子,3%的琼脂糖凝胶25毫升覆盖,作为一个阶段的幼虫上行走。顶盖持有的气味,保持悬浮液滴表面张力。
气味水滴吸管直接进入96孔盘盖的水井。可以使用一个或多个气味的来源,产生梯度分明,核查的型材2。为了测试嗅觉丧失和幼虫的趋化缺陷,我们建议使用以下两种检测。
2.1。单气味源检测:一个单一的气味液滴,奠定了良好#E7(标准96孔板参考系统)。
这有效地检测测试突变幼虫的基本嗅觉丧失。它也可以用来可靠地确定检测阈值的2个特别的气味。
2.2。多气味源检测
顶盖以及一些气味水滴被解雇。在目前的视频文章,我们设立了共6液滴沿中央行E.井#E2,E4#,#E6,#E8#E10和E12的介绍(标准96孔板参考系统梯度)。在培养皿中,单一的气味源分析与对比,多个气味源检测允许沿长度和宽度的舞台建立了渐变几何的定性控制。此实验是用来描述感官机制,使果蝇幼虫chemotax 2 。
3。梯度配置文件验证
测试在一个特定的梯度的幼虫之前,重要的是,随着时间的推移,以确定其稳定。实验者可以在此基础上,确定每个审判足够的时间和幼虫,可以在同一舞台上连续跟踪。为了测试的稳定的梯度,我们已经开发出基于红外光谱2的方法。这种方法是本协议的范围之外,并不会进一步阐述。
4。准备实验的议定书
4.1。琼脂糖凝胶板的制备和气味稀释:
注:当使用低气味的浓度,最好是准备了一套基于连续稀释的源浓度。开始,例如,一个1.0M的解决方案,并进行1:2稀释,以获得一个解决方案0.5M。出发的循环,获得了系列稀释以下几何级数1.0M,0.5M,0.25米,0.12M,0.06M,0.03M,0.015M。
重要提示:由于许多有机气味与塑料发生反应,气味稀释,必须在与铁氟龙瓶盖的玻璃瓶中。理想的情况下,气味应准备新鲜的每次实验前,以减少在整个实验的实际异味浓度的波动。当使用高挥发性化学物质,这是特别真实。
4.2。幼虫的准备:
5。议定书“的执行行为的录音
5.1。竞技场设置:
5.2。载入幼虫:
6。视频文章中表现出的样品实验
6.1。单气味源1.0M乙酸异戊酯的测定。
我们一味地测试了10个Or83b - / - 突变体和10个野生型(W1118)的幼虫,其中每一个数字被分配。跟踪实验呃没有收到任何有关每种动物的基因型信息。每个记录后,被分配了一个预测表型的每只动物测试:smellers,如果积累源下观察整个审判;非smellers,如果路径迅速离开的气味源附近。后录得的20只动物的行为,按表型路径。这个分组结果,然后用较幼虫的实际基因型:发现所有的作业是正确的。
6.2。乙酸异戊酯的指数和线性渐变多气味源检测。
在这个实验中,我们比较了野生型chemotaxing幼虫沿着一条直线和指数梯度的表演。趋化行为均录得两个相同的最高浓度为0.5m的梯度。正如在文章中解释,指数渐变的气味来源为0.015和0.5M之间。介于0.25和0.5米(与常见的差异0.05M算术级数)之间的线性渐变来源。
线性渐变代表一个更具挑战性的趋化环境,在集中的地方差异常数和相对较小的,浓度范围窄(0.25米)。相比之下,指数渐变的浓度范围内增加径沿途当地的浓度差异较大。
十五幼虫均录得每两个梯度的几何形状和一个图形叠加的路径。一两个图形的视觉检查表明,野生型幼虫能够可靠地登上为几何结构的梯度,但蜿蜒量为线性渐变条件更大。这表明沿渐变长度的信号目前是更可靠的检测指数比线性形状。
6.3。多气味,在“屋顶”的几何形状的乙酸异戊酯梯度源的检测。
在这里,我们核实介绍幼虫的气味梯度敏感的气味浓度的变化,而不是仅仅存在或没有气味。成立一个异戊梯度的气味滴的应用与以下浓度:0.06,0.12,0.25,0.5,0.25,0.12M。随后的梯度的几何形状类似于一个不对称的“屋顶”峰值在0.5M。
0.06M和0.12M的气味液滴之间的幼虫被释放。我们的假设是,如果幼虫只是计算存在的气味,他们将没有特别的偏爱浓度最高的整个渐变。相反,如果幼虫他们会积累下的0.5M液滴浓度变化非常敏感。十五幼虫,它是发现,一个简短的探索时期,所有的幼虫底浓度较高的积累。这表明,当地的气味浓度的变化计算并告知果蝇幼虫的趋化行为。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢有益的讨论T. Huber和TP Sakmar。这项工作得到了来自美国国立卫生研究院的资助LBV和比利时,美国教育基金会和雷夫森基金会ML
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