分子和免疫技术在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中

摘要

本手稿的目的是描述 试剂盒^V558Δ/+小鼠模型以及成功解剖和处理小鼠标本的技术。

摘要

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的人肉瘤，通常由KIT受体中的单个突变驱动。在各种肿瘤类型中，已经开发了许多小鼠模型，以研究下一代癌症疗法。然而，在GIST中，大多数 体内 研究使用具有固有局限性的异种移植小鼠模型。在这里，我们描述了一种免疫功能正常的，基因工程化的胃肠道间质瘤小鼠模型，该模型含有 Kit^{V558Δ / +} 突变。在这个模型中，突变的KIT是负责大多数GIST的癌基因，由其内源性启动子驱动，导致GIST模仿人类GIST中的组织学外观和免疫浸润。此外，该模型已成功用于研究靶向分子和免疫疗法。在这里，我们描述了 Kit^V558Δ/+ 小鼠群落的繁殖和维护。此外，本文详细介绍了 Kit^V558Δ/+ 小鼠中GIST，引流肠系膜淋巴结和邻近盲肠的治疗和获取，以及用于分子和免疫学分析的样品制备。

引言

GIST是人类最常见的肉瘤，在美国发病率约为6，000例¹。GIST似乎起源于称为Cajal间质细胞的胃肠道起搏器细胞，通常由酪氨酸激酶KIT或PDGFRA²中的单个突变驱动。手术是 GIST 的主要治疗方法，可以治愈，但晚期疾病患者可以使用酪氨酸激酶抑制剂 （TKI） 伊马替尼进行治疗。自20多年前推出以来，伊马替尼已经改变了GIST的治疗模式，将晚期疾病的生存率从1年提高到5年以上^3，4，5。不幸的是，由于获得性KIT突变，伊马替尼很少能治愈，因此需要新的治疗方法来治疗这种肿瘤。

小鼠模型是研究癌症新疗法的重要研究工具。GIST^6，7中已经开发并研究了多种皮下异种移植和患者来源的异种移植模型。然而，免疫缺陷小鼠不能完全代表人类GIST，因为GISTs根据其致癌突变具有不同的免疫谱，并且改变胃肠道肿瘤微环境可改善TKI治疗的效果^8，9。Kit^V558Δ/+小鼠在 Kit 外显子 11 中具有杂合子种系缺失，该基因系对并列膜结构域进行编码，这是人类 GIST¹⁰ 中最常见的突变位点。Kit^V558Δ/+小鼠发展出具有100%外显率的单个盲肠GIST，并且肿瘤具有与人类GIST⁸，^11，12，13相似的组织学，分子信号传导，免疫浸润和对治疗的反应。在这里，我们描述了Kit^{V558Δ / +}小鼠中的育种，处理以及标本分离和处理，用于GIST中的分子和免疫学研究。

研究方案

根据NIH指南和宾夕法尼亚大学IACUC的批准，所有小鼠都住在宾夕法尼亚大学的无病原体条件下。安乐死是按照宾夕法尼亚大学实验动物资源标准操作程序进行的。

1. 试剂盒^V558Δ/+ 小鼠育种

1. 使用 ^{C57BL/6J 鼠标将套件 V558Δ/+} 鼠标反向交叉 10 次以上，放到 C57BL/6J 背景上。为此，将雄性 试剂盒^{V558Δ / +} 小鼠与雌性C57BL / 6J小鼠以1:2的比例繁殖。
   注意:纯合 试剂盒^{V558Δ/ V558Δ} 基因型在子宫内是致命的。可以将雌性 Kit^{V558Δ / +} 小鼠与雄性C57BL / 6J小鼠繁殖，但窝大小约为雌性野生型C57BL / 6J小鼠的一半。此外，雌性 Kit^V558Δ/+ 小鼠在4个月大后产生有限的窝。
2. 通过脚趾剪裁对7-14天的幼崽进行基因分型，以确认 是否存在Kit^V558Δ/+ 基因型。使用前瞻引物:《中共中央》;记者1:中科院;反向引物:TTGCGTC和记者2:用于基因分型的TCTC。

2. 套件^V558Δ/+ 小鼠治疗

1. 治疗前，年龄和性别与 试剂盒^V558Δ/+小鼠相匹配。在队列中使用年龄和性别匹配的小鼠，因为来自雌性 Kit^{V558Δ / +} 小鼠的肿瘤比雄性小鼠大。在8-12周龄时治疗小鼠，此时肿瘤建立（图1）。
2. 给予酪氨酸激酶抑制剂口服或腹膜内（IP）注射; 试剂盒^V558Δ/+ 肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂敏感。在饮用水中以600mg / L的剂量提供伊马替尼，或注射45mg / kg，每日两次。如步骤3所示，在解剖肿瘤后使用数字秤测量肿瘤重量减轻，在用伊马替尼治疗后1周约为50%，在4周时约为80%（图2）。

3. 试剂盒^V558Δ/+ 小鼠器官采集

1. 通过CO₂ 麻醉以每分钟60%的腔室体积的流速对小鼠实施安乐死。呼吸停止后将小鼠留在腔室中至少2分钟，然后进行宫颈脱位以确认死亡。
2. 对所有器械进行消毒，在整个过程中戴上手套，并保持无菌区域。用70%乙醇准备皮肤。用剪刀做一个2厘米的中线垂直切口，然后进入腹腔。锐利地裂开任何腹腔内粘连。
3. 要切除引流肠系膜淋巴结，请按照以下步骤操作。
   1. 识别盲肠并更好地抬起其肠系膜。大约在结肠肠系膜底部的中间，识别肠系膜淋巴结并急剧解剖。淋巴结是灰白色的，大小约为0.5厘米x 0.5厘米。
   2. 根据需要将淋巴结组织分成三部分，以进行蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。对于单细胞悬浮液，将淋巴结组织置于20 mL血清游离培养基（RPMI）中并保持在冰上。
4. 要隔离GIST和盲肠，请按照以下步骤操作。
   1. 试剂盒^V558Δ/+小鼠中的盲肠大多被GIST取代。小心地将回肠结肠连接处与肿瘤的底部分开。要收集盲肠，再次将结肠分开，在肿瘤底部的近端2厘米处。
   2. 在50%-60%的 Kit^{V558Δ / +} 小鼠中，肿瘤的头部含有盲肠组织的盖子，其通常含有浆液，但可能很少含有脓液（图3）。尖锐地解剖帽状组织，使其远离肿瘤组织。
   3. 根据需要将肿瘤组织和/或盲肠分成三部分，用于蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。对于单细胞悬浮液，将肿瘤组织或盲肠置于含有2%FCS的HBSS中，足以覆盖样品并保持在冰上。

4. GIST组织的蛋白质印迹分析

1. 制备含有50mM三氢盐酸盐（pH 7.5），150mM氯化钠，5mM EDTA，1%非变性洗涤剂，2mM Na₃VO₄，1 mM PMSF，10mM NaF和20μl/ ml蛋白酶抑制剂混合物的组织裂解缓冲液。
2. 通过混合1800 mL去离子水，2 mL吐温20和200 mL 10x三进制缓冲盐水（TBS），制备1x Tris缓冲盐水溶液和1%吐温20（TBST）。
3. 将步骤3.4.3中的组织重悬于FACS管中，在5mL / g组织裂解缓冲液中，并用机械均质机以15，000rpm在冰上匀浆两次。在冰上孵育裂解物30分钟。
4. 将裂解物转移到1.5 mL微量离心管中。在4°C下以最大速度离心20分钟。 将上清液转移到新的微量离心管中。
5. 电泳在4%至15%梯度凝胶上裂解物，然后转移到硝酸纤维素膜上，如¹⁴中所述。
6. 在1x TBS中洗涤一次膜5分钟，然后在5%牛奶中阻断膜1小时。再次，在1x TBS中洗涤一次膜10分钟。
7. 将膜在一抗中以1:1000在4°C下以5%BSA稀释过夜。在1x TBST中洗涤膜3x，每次10分钟。将具有稀释的1:2500的二抗的印迹在室温下在2.5%牛奶中孵育1小时。
8. 在1x TBS中洗涤一次膜5分钟。加入足够的HRP底物以覆盖膜，通常为200-500μL，并使用数字成像仪检测和量化化学发光。

5. GIST组织的免疫组化

1. 将步骤3.3.2或3.4.3中的组织固定在4%多聚甲醛中，在4°C下过夜。将组织储存在70%的EtOH中，直到准备好进行处理。将厚度为 5 μm 的块嵌入和切片到载玻片上，如^15，16 所述。
2. 使用碱性免疫检测试剂盒完成免疫组化检测，如前^述17所述。

6. 肠系膜淋巴结单细胞悬液

1. 将RPMI培养基与步骤3.3.2中的淋巴结标本倒在100μm过滤器上。将过滤器移至新的50 mL锥形和麦芽浆淋巴结，并用3 mL塑料注射器的软端。用 20 mL RPMI 培养基清洗过滤器。
2. 在4°C下以450× g 离心滤液5分钟。吸出上清液。
3. 将沉淀重悬于PBS（珠状缓冲液）中的20 mL 1%FBS中，并倒在40μm过滤器上。收集细胞滤液。使用血细胞计数器计数细胞。
4. 在4°C下以450× g 离心滤液5分钟。吸出上清液。以6 x 10⁷ 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。

7. GIST的单细胞悬浮液

1. 通过添加250mg胶原酶IV，一片无EDTA蛋白酶抑制剂和100μLDNase I至50mL HBSS来制备胶原酶缓冲液。在室温下旋转10分钟直至溶解。
2. 将GIST放入无菌皿中，加入2.5 mL胶原酶缓冲液。使用无菌手术刀和剪刀切碎肿瘤，直到肿瘤呈细小碎片状。使用大口径移液管将肿瘤和胶原酶吸入50 mL管中。
3. 在37°C下以100rpm的振荡培养箱中孵育30分钟。用2 mLFBS进行淬灭反应。
4. 将胶原酶与GIST标本一起倒在100μm过滤器上，并用3mL塑料注射器的软端捣碎肿瘤，并收集在50mL管中。用 20 毫升 HBSS 清洗过滤器。将滤液在450× g，4°C下离心5分钟。吸出上清液。
5. 将沉淀重悬于20 mL磁珠缓冲液中，并倒入40μm过滤器上。收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。将滤液在450× g，4°C下离心5分钟。吸出上清液。以6 x 10⁷ 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。

8. 盲肠单细胞悬浮液

1. 按照步骤7.1制备胶原酶缓冲液。使用剪刀，纵向分开盲肠以暴露内粘膜。切成 0.5 厘米的切片，放入 50 mL 管中，管内含 5 mL HBSS，含 2% FBS。剧烈摇动30秒，以450× g 离心20秒，然后吸出上清液。
2. 加入 5 毫升 HBSS 和 2 米米 EDTA。在37°C的振荡培养箱中以100rpm孵育15分钟。以450 x g 离心20秒。吸出上清液。
3. 加入 5 毫升哈佛商学院。剧烈摇动30秒，以450× g 离心20秒，然后吸出上清液。再次重复。
4. 加入 5 mL 胶原酶缓冲液。在37°C的振荡培养箱中以100rpm孵育30分钟。每 10 分钟用力摇晃一次。用2 mLFBS进行淬灭反应。
5. 将胶原酶与盲肠标本倒在100μm过滤器上，并用3 mL塑料注射器的软端捣碎。用 20 毫升 HBSS 清洗过滤器。收集滤液。
6. 在4°C下以450× g离心滤液5分钟。 吸出上清液。将沉淀重悬于20 mL珠缓冲液中，并倒在40μm过滤器上。收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。
7. 在4°C下以450× g离心滤液5分钟。 吸出上清液。以6 x 10⁷ 个细胞/ mL重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。

结果

Kit^V558Δ/+小鼠模型允许在免疫功能小鼠模型中研究治疗方法。由于进行性肠梗阻，Kit^{V558Δ / +}小鼠的平均寿命为8个月（图4）。来自Kit^{V558Δ / +}小鼠的肿瘤表达GIST的规范标志物，包括酪氨酸激酶KIT和跨膜通道DOG1（图5）以及转录因子ETV1（未显示）。可以研究肿?...

讨论

试剂盒^V558Δ/+小鼠模型是GIST分子和免疫学分析的强大研究工具。虽然育种策略需要单次杂交，但在分析肿瘤反应的实验中使用Kit^V558Δ/+小鼠队列需要广泛的育种。小鼠的年龄和性别应匹配，以确保相似的肿瘤重量，并且10%的小鼠在肿瘤建立时在8周龄之前死亡。如果使用先进的成像技术（如CT或MRI）来跟踪个体小鼠内的肿瘤体积，则可能采用不太广泛的育种策略。尽管?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 micron filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC lysis buffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL syringe	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyde Solution	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 micron filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 micron filter	EMSCO	1194-2350
AKT antibody (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta free protease inhibitor	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 antibody	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT antibody (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotyping	Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm	Rio-Rad	1620145
Nonfat Dry Milk	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT antibody (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT antibody (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 platform	Scanco medical